167256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein tisztítására

167256 9 10 Az inkubált elegyet ezután éjszakán keresztül ionmentesített vízzel szemben dializáljuk, majd a dializálást 6,0 pH-jú 0,005 mólos foszfát-pufferrel szemben folytatjuk. A dializált elegyet 0 °C-on 20 000 G-vel 1 órán keresztül centrifugáljuk, végül Versapore mikroszűrőn szűrjük. A szűrlet pH-ja 6,3, vezetőképessége kb. 250 ohm-1

. A kezelés hatására az oldat orgotein-tartalma a kezdeti kb. 0,2%-os értékről kb. 5%-ra emelkedett. A szűrletből a tiszta orgoteint az alábbiak szerint különítjük el. 8,5 ml ágytérfogatú oszlopot „DEAE 52" dietilaminoetilcellulózzal töltünk meg, majd az oszlopot 6,0 pH-értékű 0,005 mólos foszfátpufferrel töltjük fel. 253 ml fentiek szerint előállított szűrletet (ez a mennyiség 82 g májnak felel meg) öntünk az oszlopra, majd 20 ml/óra sebességgel adszorbeáltatjuk. Az oszlopot ezután 30 ml 6,0 pH-jú 0,005 mólos foszfátpufferrel mossuk. Az orgoteint lineáris gradiens elucióval mossuk le az oszlopról. 0,005 mólos 6,0 pH-jú foszfátpufferrel kezelve és 0,005 mólos 6,0 pH-jú 0,075 mól NaCl-t tartalmazó eluálószerrel befejezve. Az eluálószer térfogata összesen 170 ml volt. Az orgotein-csúcs helyzetét NBT-enzimmel történő jelzéssel [Beanchamp és Fridovich, Anal. Biochem. 44, 276 (1971)] a szennyezések helyzetét „Coomassie" kék proteinnel történő jelzéssel állapítottuk meg agarózon végzett elektroforézissel. Á szennyezésmentes orgoteint tartalmazó frakciókat és az orgoteint és szennyezéseket tartalmazó frakciókat külön-külön egyesítjük, majd dializáljuk, stabilizálás céljából szacharózt adhatunk hozzájuk, majd a frakciókat szűrjük és liofilizáljuk. A tiszta orgotein hozama 27,6 mg (a kiindulási anyagként alkalmazott májra számolva 0,034%, az elméleti mennyiség 62%-a). A tiszta orgoteint súlya 10,0 mg (0,012%, az elméleti mennyiség 22%-a). Az elkülönített orgotein teljes mennyisége az elméleti mennyiség 82%-ának felel meg. A tiszta orgoteint más proteolitikus enzimmel — például Pronázzal — vagy gélszűréssel vagy ioncserélő kormatográfiával tovább tisztíthatjuk. 5. példa Az 1. vagy 2. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy proteolitikus enzimként acetilcellulózhoz vagy karboximetilcellulóz-hidrazidhoz kapcsolt Pronázt (Enzitet) alkalmazunk a példákban szereplő Pronázzal ekvivalens mennyiségben. Az emésztés után kapott keverékből, mely a protlinekre számítva 30—50% orgoteint tartalmaz, a Pronázt szűréssel elkülönítjük és az orgoteint a szűrletből a fent megadott módon elkülönítjük. 6. példa Az 5. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként protein szennyezést tartalmazó 70—97% tisztaságú 1% töménységű orgotein-oldatot alkalmazunk. Az oldat puffer- és sótartalma: 0,025 mól trisz, 0,025 mól glicin, 0,001 mól CaCl2

. Az oldatot két napon keresztül 37 °C-on kezelve a proteinszennyezések teljesen lebontódnak. A tiszta orgote int szűréssel, dialízissel és liofilezéssel különíthetjük el. 98%-ot meghaladó tisztaságú orgoteint kapunk. 7. példa 5 Marhamáj oldható és oldhatatlan proteinjeit a 4. példában ismertetett módon, vagy ultrahangos roncsolással vagy nagy nyomáson végzett szűréssel elkülönítjük, majd az oldatot centrifugáljuk. Ezután proteinekre számítva 2—3% orgoteint tartal-10 mázó Puffernd a felülúszó pH-ját 6,0-ra állítjuk be, az oldatot gyorsan 65—80 °C-ra melegítjük és 15— 90 percen keresztül ezen a hőmérsékleten tartjuk. Az elegyet lehűtjük 37 °C-ra, a kivált voluminózus csapadékot centrifugálással vagy szűréssel elkülö-15 nitjük. A kapott oldat maradék proteintartalma kisebb az extrahált proteinek 10%-ánál, orgotein»tartalma kb. 200 mg/ml. A hőkezelt extraktum pH-ját 1 mólos triszpufferrel 7,5-re állítjuk be, majd 37 °C-on kb. 20 3 g/liter extraktum mennyiségben pankreatint vagy 50 mg/liter extraktum mennyiségben Pronázt adunk az elegyhez. Az elegyet 2 napon át állni hagyjuk, majd lehűtjük szobahőmérsékletre és a 4. példában megadott módon dializáljuk. A dializá^ 25 tumból mely a proteinekre számítva 40—60% orgoteint tartalmaz az orgotein kívánság szerint DEAE cellulóz oszlopon történő kromatografálással — például a 4. példában leírt módon — különíthető el. 30 8. példa A 7. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az ott említett hőkezelést centrifugálás előtt végezzük, s így egy el-35 különítési lépést elhagyunk. E módosítás révén az orgoteinnel együtt a májból extrahált protein mennyisége több mint 80%-kal csökkenthető. A proteinekre számítva 40—60% orgoteint tartalmazó terméket kapunk. 10 9. példa A 7. vagy 8. példában ismertetett eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az emésztést először pankreatinnal, majd két nappal később 45 oldhatatlan hordozóanyagon adszorbeált Pronázzal végezzük. Az enzimek mennyisége megfelel a 7. példában megadottnak. 1 kg májból 300—400 mg orgoteint kaphatunk ily módon 50—75% tisztaságban. 50 10. példa A 8,„ példában közölt eljárást ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy az extrakcióra alkalmazott puffer mennyiségét 25—75%-kal csökkentjük. 55 A hozam kis mértékben csökken, a termék tisztasága nem változik. 11. példa A 8. példában ismertetett eljárást ismételjük 60 meg, azzal a különbséggel, hogy kiindulási anyagként máj helyett hasonló súlyú mosott és pufferolt marhaeritrocitát, lóeritrocitát vagy humán eritrocitát alkalmazunk. A) 100 ml lóeritrocitát, mely 0,0005—0,007% 65 orgoteint tartalmaz, citrásos konyhasóoldattal mos-5