167256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás orgotein tisztítására
167256 11 12 suk, és kétszeri fagyasztással és azt követő felolvasztással bontjuk. A lizátumot 5,4 pH-ra titráljuk jégecettel, és frakcióként hőkezelésnek vetjük alá, 65 °C-on, 15 percig. A vérpigment kicsapása végett a hőkezelt mintát 7,5 pH-ra titráljuk. A 0,03—0,05% orgoteint tartalmazó felülúszó egy részét acetonnal frakcionáljuk, egy másik részét pedig 1,5 mg/ml koncentrációjú pankreatinnal kezeljük 37 °C-on, 15 órán át. Ezután mindegyik mintát négyszeresére hígítjuk vízzel, és az orgotein-és protein-tartalmat elektroforézis alapján becsüljük. A 0,75—1,5 térfogatú acetonos frakció 60% orgoteint és 10%-nál kevesebb proteint tartalmaz a vizsgált mintában. Ez az oldható proteinekre számítva 0,7—1% orgoteinnek felel meg. A pankreatinnal kezelt minta ennél több, az oldható proteinekre számítva 4—6% orgoteint tartalmaz. Teljes protein-tartalma ugyanakkor kisebb az acetonnal frakcionált mintáénál. Mindkét minta alkalmas kromatográfiás feldolgozásra. B) Az A) bekezdés szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az oldható proteinekre számítva 0,03% orgoteint tartalmazó lóeritrocita lizátumot 7,5 pH-ra titráljuk, és a pankreatint a lizátum előzetes hőkezelése nélkül adjuk hozzá. A kezelést 32 C°-on, 15 órán át végezzük, 0,6 mg/ml, 0,75 mg/ml, 1 mg/ml és 1,5 mg/ml pankreatin koncentrációval. Minden mintánál sikerült az orgotein teljes mennyiségét kinyerni. A protein-koncentráció a pankreatinnal való kezelés során csökkent (az orgotein-tartalom 0,1% az oldható proteinekre számítva), azonban közel sem olyan nagy mértékben, mint az előző példa szerinti, előzetes hőkezelésnek alávetett mintánál. C) 0,0005—0,007% orgoteint tartalmazó citrátos teljes marhavért vízzel 40%-osra hígítunk. 15 órán át inkubáljuk 37 °C-on, 7,5 pH-nál, 0,1% nátriumazid és 3 és 6 mg/ml pankreatin jelenlétében. Az orgotein teljes mennyiségét kinyerjük, a protein mintegy fele marad vissza. A kapott anyag az oldható proteinekre számítva 0,03—0,05% orgoteint tartalmaz. A hígított vér másik mintáját két órán át hőkezeljük 75 °C-on, a pH-t 7,4-re állítjuk be, és a mintát 1 és 3 mg/ml pankreatinnal kezeljük. Az orgotein több mint 60%-át nyerjük ki, az eredeti proteinmennyiség mintegy 2%-ra csökken. A csupán hőkezelésnek alávetett mintában mintegy kétszer annyi protein maradt (az orgotein-tartalom 0,5—1% az oldható proteinekre számítva), mint a hőkezelésnek és az azt követő pankreatinos bontásnak alávetett mintánál. Ez utóbbiban az oldható proteinekre számított orgotein-tartalom 2—4%. 12. példa Az 1—4. és 7—11. példában leírt eljárásokat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pankreatinnal végzett emésztés után a protein-jellegű szennyezések további csökkentésére és az orgoteinoldat töményítésére 0,5 és 1,5 térfogatnyi acetonnal frakcionált kicsapást végzünk. A csapadékot a továbbiakban kromatográfiás úton tisztíthatjuk; e célból DEAE-cellulóz oszlopot alkalmazhatunk. A tisztítás során 1 ml adszorbens-térfogatra legalább 30 g májjal egyenértékű oldatot számíthatunk. 13. példa A proteolitikus emésztés hatásának vizsgálatára teljes marhamájat, marhamáj oldható proteinjeit és hőkezelt oldható marhamáj-proteineket pankrea-5 tinnal kezelünk. Az oldható marhamáj-proteinek elkülönítésére 5ÖÖ g marhamájat (szárazanyagtartalom: 150 g/l liter 0,25 mól trisz-puffert, 0,025 mól glicin-puffert és 0,01 mól Mn++ -iont tartalmazó oldattal elegyí-10 tünk. A kapott 1380 ml szuszpenzió 100 ml-es részleteit a következőképpen kezeljük: a) a szuszpenziót 1 órán keresztül 13 000 g-vel centrifugáljuk. Ilyen módon 78 ml felülúszót kapunk, amely a kiindulási anyagként alkalmazott 15 máj oldható protein-tartalmának 100%-át ós orgotein-tartalmának 100%-át tartalmazza. A felülúszó szárazanyagtartalma 6 g, az eredeti menyiség kb. 2/3-a. Az oldható proteinekre számított orgotein tartalom 0,2%. 20 b) 78 ml a) lépés szerint készített felülúszót 37 C°-on 24—28 órán keresztül 7,5 pH-n 300 mg pankreatinnal emésztünk. A kapott oldat a kiindulási anyagként alkalmazott máj orgotein-tartalmának 100%-át, oldható protein-tartalmának < 10%-át 25 tartalmazza. Az oldható proteinekre számított orgotein-tartalom 2—3%. c) 100 ml kiindulási májszuszpenziót 15 percen keresztül 65 °C-on hőkezelünk, majd az elegyet lehűtjük és centrifugáljuk. Ilyen módon 78 ml felül-30 úszót és 7,6 g (89,5%) oldhatatlan protein-csapadókot kapunk. A 78 ml felülúszót ezután a b) lépésben ismertetett módon enzimatikusan kezeljük. A kapott oldat a kiindulási anyagként alkalmazott máj orgotein-tartalmának 100%-át és összes old-35 ható proteintartalmának <6%-át tartalmazza. Az oldható proteinekre számított orgotein-tartalom 3-6%. d) 78 ml a) lépés szerint előállított felülúszót a c) lépésben ismertetett módon hőkezelésnek vetünk íO alá. A centrifugálással 60 ml 2,70 g szárazanyagtartalmú felülúszót és 2,05 g csapadékot kapunk. A 60 ml felülúszót a b) lépésben ismertetett módon proteolitikus enzimmel kezeljük. Az emésztés után az oldat 3—6% oldható proteint tartalmaz. Az 45 oldható proteinekre számított orgotein-tartalom 3-6%. A példában kapott eredményekből látható, hogy az enzimatikus emésztés előtt végzett hőkezelés hatásosabb: a c) és d) pont szerinti eljárások vég-50 terméke a teljes oldható proteintartalomnak csak 3—6%-át tartalmazza, míg a b) lépés szerinti oldat proteintartalma nagyobb, mint az eredeti mennyiség 6%-a. 55 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás protein-keverékekben, különösen marhamáj hőkezelés után oldatban maradó proteinjei-60 nek keverékében levő orgotein tisztítására és elkülönítésére, a proteinek mennyiségének enzimes lebontással való csökkentése útján, azzal jellemezve, hogy az orgoteint tartalmazó keveréket 0 °C- és 60 °C közötti hőmérsékleten, vizes oldatban proteoli-65 tikus enzimmel kezeljük, és az enzimatikusan le-6
