167238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új hipokalcémiás hatású peptidek előállítására
67 167238 68 80%-os metanolban oldunk és az oldatot 0,3 g 10%os palládium-szén-katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. A hidrogénfelvétel megszűnése után a katalizátort leszűrjük, az oldatot bepároljuk és a maradékot nagy vákuumban, 35° fürdőhőmérsékleten szárítjuk. így a H-Val-Gly-Ala-Pro-N2 tetrapeptidet színtelen anyagként kapjuk, Rf-érték (szilikagéles lemezek, kloroform-metanol 1:1 rendszer) = = 0,20. 43. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pri-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 800 mg, 37. pontban. leírt peptidszármazékot, 500 mg H-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyületet és 170 mg N-hidroxiszukcinimidet 10 ml dimetilformamidban oldunk, nagy vákuumban kb. felére pároljuk és 250 mg diciklohexilkarbodiimidet adunk hozzá. Egy éjszakai szobahőmérsékleten történő keverés után éterrel kicsapjuk, és az anyagot elválasztjuk. Ezután Craig-extrakcióval tisztítjuk, metanol-puffer- (mint a 3. példa 13. pontjában)-kloroform-széntetraklorid (10:3:5:6) elegyben, K = 0,29. A megoszlatásból izolált tiszta termék szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során Rf107 = = 0,62 értéket ad. 44. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Qla-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 300 mg fenti peptidszármazékot 30 ml 80%-os ecetsavoldatban oldunk és 100 mg 10%-os palládium-szén-katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Teljes dekarbobenzoxilezés után a katalizátort leszűrjük, a szűrletet nagy vákuumban 30°-on erősen bepároljuk és a maradékot 5-butanolból liofilizáljuk. A maradékot 10 ml metanolban oldjuk, 1 n nátriumhidrogénkarbonátoldat hozzáadásával enyhén meglúgosítjuk és 0,1 n nátriumkarbonátoldatot hozzácsepegtetve kicsapjuk. Az izolált terméket mégegyszer ugyanígy kicsapjuk. Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás eljárás során Rf10o = = 0,34. 45. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr (tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 288 g fenti terméket, 181 mg 12. pontban leírt peptidszármazékot és 46 mg N-hidroxiszukcinimidet 2 ml dimetilformamidban oldunk, nitrogéngázbevezetés közben 45°-on. 52 mg diciklohexilkarbodiimid hozzáadása után még 3 órán át 45°-on melegítjük, majd peroxidmentes éterrel kicsapjuk és a terméket elválasztjuk. A tisztítás Craig-megoszlatással történik, metanol-puffer (mint a 3. példa 12. pontjában)-kloroform-széntetraklorid (11:3:6:7) rendszerben; K = 0,74. A megoszlatás után izolált tiszta termék vékonyrétegkromatogramja Rf52A = 0,4 és Rf100 = = 0,35 értékeket mutat (szilikagélen). 3. példa H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly--Thr-Tyr-Thr-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2-acetát (Asn 15 -kacitonin M acetát) 53 mg, lehetőleg legfinomabbra porított BOC--Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2 vegyülő letet 2 ml tömény sósavban 0°-on oldunk, és 5 percig sósavgázzal átöblítjük. Ezután a gázalakban oldott sósavat nagy vákuumban eltávolítjuk, 4 ml jéghideg vízzel hígítjuk az oldatot és a terméket Amberlite CG—45 (enyhén bázikus acetátciklusú ion-15 cserélő) oszlopon acetáttá alakítjuk át, majd liofilizáljuk. így a terméket színtelen liofilizátumként kapjuk. Az UV-spektrum 10%-os ecetsavoldatban 275 nm-nél mutat maximumot (e7 = 1700). Vékony-20 rétegkromatogramon cellulózos lemezen (Selecta-n) Rf45 = 0,48, Rf101 A = 0,49, alumíniumoxidon (Alox, Camag) Rf79 = 0,57. Elektroforézis során 280 V feszültségnél 1,5 óra alatt cellulóz Selecta-lemezeken az anyag 1,9 PH 25 mellett (ecetsav-hangyasav puffer) a katód irányába vándorol 3,5 cm-t. A kiindulási anyagot a következőképpen állítjuk elő: 30 1. Z-Gln-Asn-Phe-OMe 14,5 g Z-Gln-ONP vegyületet és 10,8 g Asn-Phe-OMe-hidrokloridot [Ann., 688, 259 (1965)] 100 ml dimetilformamidban oldunk és lassan 4,55 ml trietilamint adunk hozzá. Sűrű paszta keletkezik, melyet 35 50 ml dimetilformamiddal hígítunk. 24 órás, szobahőmérsékleten történő reakció után leszűrjük és a maradékot dimetilformamiddal mossuk. Op.: 261— —265° (bomlás közben). 40 ["ID = +11° (o = 0,94, hexametilfoszforsavtriamidban). 2. H-Gln-Asn-Phe-OMe-hidroklorid 14,1 g Z-Gln-Asn-Phe-OMe vegyületet 800 ml me-45 tanolban 8,5 ml 3 n dioxános sósavoldat és 2,4 g 10%-os palládium-szén-katalizátor hozzáadásával 45°-on hidrogénezünk. A hidrogénfelvétel megszűnése után leszűrjük és bepároljuk. A maradékot minden további tisztítás nélkül felhasználjuk. Szili-50 kagélen végzett vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban Rf52A = Rf45 = 0,31, Rf43A = 0,50. 3. Z-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OMe 9,3 g H-Gln-Asn-Phe-OMe-hidrokloridot és 11,9 g Z-Thr(tBu)-OSU vegyületet 150 ml dimetilforma-55 midban átlátszó oldattá oldunk. Ezután 2,85 ml trietilamin 10 ml dimetilformamidos oldatát csepegtetjük hozzá és 21 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután vákuumban bepároljuk, a maradékot sok etilacetát-kloroform (9:1) elegyben felvesz-60 szűk és 2X200 ml 5%-os citromsavoldattal és IX100 ml vízzel kirázzuk. Ezután leszűrjük az oldhatatlan csapadékot, a szűrletet még kétszer 200 ml 2 n nátriumkarbonát-oldattal és 3X 100 ml vízzel kirázzuk, nátriumszulfáttal szárítjuk és bepároljuk. 65 A bepárlási maradékot a fent kapott szüredékkel 34
