167228. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-tirozin-származékok előállítására
3 tehát a reagáló anyagok aktiválására az 5—7 pH-értéken hatásos, mintegy 4000—6000 Hb aktivitású papaint, továbbá adott esetben a papaint aktiváló enyhe redukálószerként ciszteint használunk. A papin aktivitásáról Colowick és Kaplan (Methods 5 in Enzymology, 19. kötet, 235. oldal) írnak. A papain és a cisztein mennyisége a reakció végbemenetele szempontjából nem döntő, csak a reakciósebességet befolyásolják. A minimális mennyiség az enzimkészítmény aktivitásától függően 0,1 mól ki- 10 indulási anyagra 2—4 g papain, a cisztein koncentrációja a reakciókeverékben előnyösen 0,005 mól körül van. Az első reakciólépés csaknem kvantitatív kitermeléssel zajlik le. Az 5—7 pH-nál, előnyösen 5,6 és 6,2 között vég- 15 bemenő anilidszintézis során a megfelelő pH-értéket a szokásos pufferokkal, például citrát- vagy foszfátpuffer-oldattal állítjuk be. [A proteolitikus aktivitás 1 g enzimkészítményre vonatkoztatott megadására használt Hb-egység 20 (hemoglobin-egység) meghatározását az Official Methods of Analysis of the Association of Afficial Agricultural Chemists (11. kiadás, 1970) ismerteti.] Az anyalúgból közel kvantitatív mennyiségben visszakaphatjuk az II általános képletű vegyületek 25 D-módosulatát, és ezt ismert módon racemizálhatjuk. Ha a kiindulási vegyületekben R és R1 jelentése megegyezik a végterméknél megadottal, akkor a hidrolízist előnyösen híg savoldattal melegítés köz- 30 ben végezzük, például 10%-os sósavval visszafolyatási hőmérsékleten. A hidrolízist erősebb savakkal, például tömény hidrogénbromiddal is végezhetjük, különösen akkor, ha a jelenlévő éterkötéseket is egyidejűleg fel kell hasítani. 35 A következő példák közelebbről szemléltetik a találmány szerinti eljárást. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban adjuk meg. A példákban használt papain 6000 Hb aktivitású. 40 1. példa L-N-Benzoil-3-metoxi-tirozil-anilid 31,5 g (0,1 mól) DL-N-benzoil-3-metoxi-tirozint melegítés közben feloldunk 200 ml 0,05 n nátriumhídrocid oldatban, Ezután hozzá- 45 adunk 150 ml a 2 mólos nátriumacetát-oldatot, majd a keveréket szűrjük. Végül a víztiszta oldathoz először 300 ml 0,1 n citrátpuffert (pH értéke 5,0), majd 2 g ciszteiniumkloridot és 18 ml desztillált anilint adunk. Ezután hozzá- 50 adjuk 3 g papainnak 300 ml 0,05 n citrát-pufferral készült oldatát, és j égecettel vagy n nátriumhidroxidoldattal a pH értékét 5,8-ra állítjuk be. Már rövid idő után megkezdődik az L-anilid kiválása. Körülbelül 48 óra múlva leszívatjuk, 300 ml vízzel mos- 55 suk, és szárítjuk. Az anilidet metanol és víz elegyéből átkristályosítjuk. Kitermelés kvantitatív. Olvadáspontja 208,0—208,5°. [afB o = + 40,0° ± 0,15° (c= 1, metanolban). Elemi összetétel a C23 H 2 2N 2 0 4 képlet szerint 60 molekulasúly 390,45): számított: C 70,75%, H 5,68%, N 7,18%; talált: C 70,58%, H 5,70%, N 7,00%. Az anilid leszívatása után visszamaradó anyalúgot 80°-ra melegítjük, és 100 ml metanol hozzá- 65 4 adása után tömény sósavval a pH értéket 2,0-re állítjuk be. Lehűtjük, leszívatjuk és szárítjuk. A kapott D-N-benzoil-3-metoxi-tirozint ezután racemizálhatjuk, és ismét felhasználhatjuk kiindulási anyagként. 2. példa L-3-Hidroxi-tirozinná való elszappanosítás 9,75 g (25 mól) L-N-benzoil-3-metoxi-tirozilanilidet 50 ml 48%-os hidrogénbromid-oldattal 7 óra hosszat visszafolyatás közben forralunk. Lehűtjük, és a kivált benzoesavat leszívatjuk. Kevés hideg 48%-os hidrogénbromid-oldattal mossuk. Az enyhén barnássárga színű oldatot vákuumban besűrítjük. Miután szárazra bepároltuk, hozzáadunk 50 ml desztillált vizet, és ismét bepároljuk. A maradékot feloldjuk 50 ml metanolban, és tömény ammónia oldattal 6 pH értékre állítjuk, amikor is az L-3-hidroxi-tirozin kiválik. Éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk, leszívatjuk, és legfeljebb 50°-on szárítjuk. Kitermelés 5,0 g. A kapott vegyületet 180 ml forrásban lévő vízben feloldjuk, aktívszénen szűrjük, és nitrogéngáz alatt 20°-ra lehűtjük. A kristályosodás kezdetéig ezen a hőmérsékleten hagyjuk, majd éjszakán át hűtőszekrényben tartjuk. A következő napon leszívatjuk, és legfeljebb 50°-on szárítjuk. Kitermelés 3,4 g (69,2%). Az anyalúg még 0,9 g L-3-hidroxi-tirozint tartalmaz. Az összkitermelés 4,3 g (87,4%). Olvadáspontja 290° (bomlik). [afD °=— 12,15±0,13 (c = 4, n sósavban). Azonos eredményt kapunk, ha proteázként bromelint, illetve ficint használunk. 3. példa L-3-Metoxi-tirozinná való elszappanosítás 9,75 g (25 mmol) L-N-benzoil-3-metoxi-tirozil-anilidet keverés közben 100 ml 10%-os sósavval 16 óra hosszat visszafolyatás közben forralunk. Ezután leszívatjuk, és több ízben éterrel kirázzuk. A vizes fázist aktívszénen szűrjük, és vákuumban szárazra bepároljuk. A maradékot acetonban oldjuk, és dietilaminnal 6 pH-ra állítjuk. Ezután a kris^ tályosodás kezdetéig szobahőmérsékleten vagy éjszakán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. Leszívatjuk, és szárítjuk, majd vízből átkristályosítjuk. Kitermelés 4,1 g (71,6%). 40°-on való szárításnál az L-3-metoxi-tirozint monohidrát alakjában kapjuk. Olvadáspontja 241—242°. [a]2 D °=— 5,83° (c=l n sósavban). 4. példa L-N-Benzoil-4-metoxi-m-tirozil-anilid 31,5 g (0,1 mól) DL-N-benzoil-4-metoxi-m-tirozint melegítés közben feloldunk 200 ml 0,5 n nátriumhidroxid-oldatban. Ezután hozzáadunk 150 ml 2 mólos nátriumacetát-oldatot, majd szűrjük. A víztiszta oldathoz keverés közben 300 ml 0,1 n citrátpuffert (pH értéke 5,0), majd 2 g ciszteiniumkloridot és 18 ml desztillált anilint adunk hozzá, végül hozzá adjuk körülbelül 3 g papainnak 300 ml 0,05n citrátpufferral készült oldatát, és a pH értékét jégecettel vagy n nátriumhidroxid-oldattal 5,8-ra állítjuk.35°-on 48 óra hosszat keverés közben reagál-2
