167128. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új komplex antibiotikum, a violamicin és összetevői előállítására
167128 3 4 A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy aerob körülmények között megfelelő szén- és nitrogénforrásokkal, valamint ásványi sókkal ellátott folyékony tápközegben az IMET JA 6844 sz. Streptomyces violaceus törzset 25-37 C°-on szellőztetés és keverés mellett 2-6 napon át tenyésztjük, a tenyészfolyadékot a micéliumtól elválasztjuk, az antibiotikumot szerves oldószerrel a micéliumból és a tenyészfolyadékból extraháljuk és az extraktumból alacsony forráspontú szénhidrogén hozzáadásával kicsapjuk. A kapott antibiotikumot alkalmas kromatográfiai eljárásokkal tisztítjuk. E célból az említett kicsapás során kapott nyers terméket valamilyen 1-5 szénatomos alifás alkoholban oldjuk és ®LH20 jelzésű Sephadex-szel végzett metanolos gélszűrés útján a biológiailag nem aktív kísérőanyagokat eltávolítjuk. A komplex antibiotikumot ezután adott esetben az A, Bt és B n violamicin-frakciókra szétválasztjuk. Eluensként metanolt alkalmazunk. Az IMET JA 6844 törzs tenyésztése aerob körülmények között történik. A törzs spóraanyagát földdel keverve liofilezéssel szárítjuk, utána alkalmas agartáptalajokba, majd folyékony, előzőleg sterilizált tápközegbe oltjuk, és a képződő micéliumot önmagában ismert módon 25 és 37 C közötti, előnyösen 28 C° hőmérsékleten 2-6 napon, előnyösen 4 napon át tenyésztjük. A tenyészetfolyadék pH értéke a tenyésztés elején 6,2-7,0, a végén 7,5-8,3. A tápközeg szén- és nitrogénforrásokat, valamint szervetlen sókat tartalmaz. Szénforrásként keményítőt, glükózt, glicerint, mannitot, dextrint, szacharózt, szójaolajat és szójalisztet alkalmazunk. Nitrogénforrásként az említett nitrogéntartalmú szubsztrátumokon kívül száraz élesztő, húspepton és kazein is szóba jöhet. Jó fermentációs eredmények érhetők el ásványi sók hozzáadásával. Az utóbbiak az alkalmazott tápközegtől függően elősegítik a fermentáció lefolyását. Gabona-, szója- vagy hallisztet tartalmazó komplex közegekben előnyösnek bizonyult kalciumkarbonát, nátriumfoszfát, illetve káliumfoszfát hozzáadása. A termelő törzset különböző űrtartalmú edényekben, így lombikokban, üvegfermentorokban vagy V2A-tankokban fermentálhatjuk. A violamicin pigment-antibiotikumot úgy különítjük el, hogy a tenyészet-szűrletet szerves, vízzel nem vagy csak kevéssé elegyedő oldószerrel, a micéliumot szerves, vízzel elegyedő oldószerrel extraháljuk, az extraktumok feldúsítása után a violamicint vizes fázisba visszük át és a 3,0-9,0, előnyösen 8,2 pH-jú vizes fázisból szerves, vízzel nem elegyedő oldószerrel ismét extraháljuk, majd a feldúsított koncentrátumból petrolétert vagy benzint hozzáadva keverés közben kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük, kloroformban feloldjuk, az oldhatatlan üledéket szűréssel eltávolítjuk, és az oldatot vízzel kimossuk. A kimosott oldatot újra feldúsítjuk, majd az A frakciót petroléteres kezeléssel kicsapjuk, rövid szénláncú alkoholokban oldjuk, oszlopkromatográfiai úton tisztítjuk, és a biológiailag inaktív ágiikon A violamicinonra, valamint a biológiailag aktív A violamicin antibiotikum-komplexre bontjuk. A B-frakciót a kloroformos extraktum mosóvizéből 6—9 közötti pH-érték mellett butanollal extraháljuk, az extraktumot feldúsítjuk és az elegyet petroléterrel kezelve az antibiotikumot kicsapjuk, a kapott B frakciót rövid szénláncú alkoholokban oldjuk és kromatográfiai 5 úton B violamicinre és biológiailag inaktív B violamicinon aglikonfrakcióra bontjuk. Az oszlopkromatográfiával végzett szétválasztást A violamicinekre, a B violamicin alkotórészeit képező B! violamicinekre és Bn violamicinekre, 10 valamint az A és B aglikonfrakcióra a nyers termékből kiindulva végezhetjük. Ugy is eljárhatunk, hogy az A és B antibiotikum-frakciókból indulunk ki. Az eddig antraciklin-antibiotikumok tisztítására használt módszerekkel szemben mindkét 15 esetben az ®LH20 jelzésű Sephadex-szel Pharmacia, Uppsala, Svédország, végzett gélszűrést alkalmazunk. A nyers terméket, illetve az antibiotikum A és B frakcióját kevés metanolban oldjuk, és a komponenseket ®LH20 Sephadex-szen oszlop-20 kromatográfiával szétválasztjuk. Ha a kiindulási anyagként a nyers antibiotikum-terméket használjuk, az eluálási sorrend az alábbi: Bt violamicin, Bn violamicin, A violamicin és egy összaglikonfrakció. Ha előállított A frakcióból indulunk ki, 25 először az A violamicin, utána az A violamicin aglikonfrakció eluálódik. Az előtisztított B frakcióból kiindulva a frakciók Bi violamicin, Bn violamicin és B violamicin aglikonfrakció sorrendjében keletkeznek. 30 Az A és B violamicinfrakció cukorvegyület-tartalomban különbözik egymástól, és papírkromatográfiai módszerrel hat különféle komponensre bontható. Az A és B violamicin hidrolizátumai azonos 35 aglikonkomponenseket adnak, az egyes komponensek mennyisége azonban eltérő. Az A és B violamicin aglikonfrakciók ugyancsak az aglikonkomponensek mennyiségi arányában különböznek egymástól. 40 A hidrolizátumokból nyert aglikonkeverékeket oszlopkromatográfiával szétválasztottuk, és a kapott Aj -A6 , illetve B!-B 6 violamicinon aglikonokat egymással összehasonlítva megállapítottuk, hogy azok antraciklinon-vázú vegyületek. 45 Az A violamicin amorf vörösbarna anyagok komplexuma, amely kloroformban, acetonban és alkoholokban jól, benzolban- kevéssé és éterben, valamint vízben egyáltalán nem oldódik. Az A violamicin indikátortulajdonságokkal bír, savas ol-50 datokban vörös, lúgos oldatokban kék színű. A B violamicin amorf vörösbarna anyagok komplexuma, amely vízben, rövidszénláncú alkoholokban, acetonban és kloroformban jól oldódik, benzolban, petroléterben és éterben viszont nem oldódik. A B 55 violamicin szintén indikátortulajdonságokkal rendelkezik, és savas oldatokban vörös, lúgos oldatokban kék színt mutat. Az indikátortulajdonságok, valamint a vörösbarna szín miatt a violamicint pigmentantibiotikumnak nevezhetjük. Szerkezetét te-60 Mntve a violamicin az antraciklinekhez tartozik. Az antraciklinekhez tartoznak például a daunomicin-, pirromicin- és rodomicincsoportbeli antibiotikumok, melyek alapváza az antrakinon. A violamicinon Ai(Bi), A2 (B 2 ) és A 6 (B 6 ), 65 mint az ismert rodomicinon, illetve izorodomici-2
