167097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens trigliceridek meghatározására

167097 3 Ezért a találmány feladata az említett hátrányok kiküszöbölése és eljárás kidolgozása a trigliceridek meghatározására enzimatikus elszappanosítás útján, melynél a szükséges ljpáz-mennyiség és idő-felhasználás jelentősen csökken és 5 ezenfelül a kicsapódó szappanok leválasztása is feleslegessé válik, Ezt a feladatot a találmány értelmében olyan eljárással oldjuk meg, melynél a triglicerideket lipáz segít- 10 ségével történő elszappanosítás után, a felszabaduló glicerin mérésével határozzuk meg és az elszappanosítási karboxilészteráz és 10-15 szénatomszámú alkilgyököt tartalmazó alkáli- vagy alkáliföldfém-alkilszulfát jelenlétében végezzük el. Előnyösen szérumalbu- 15 min jelenlétében dolgozzunk. •Lipázként előnyösen Rhizopus arrhizusból nyert lipázt alkalmazunk. Karboxilészterázként (EC 3.1.1.1) előnyösen karboxilészter-hidrolázt- 20 főleg disznómáj-észterázt használunk, de más karboxilészterázok is alkalmazhatók. Körülbelül 100/ug észteráz teljesen elegendőnek bizonyult. Az alkilszulfátok közül előnyben részesítjük az 25 alkálisókat, mivel a felszabaduló zsírsavakkal nem képeznek oldhatatlan szappanokat. A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósításánál szérumalbumin alkalmazása mellett alkáliföldfém-alkilszulfátok is használhatók. Előnyben részesül a 30 dodecilszulfát, mivel a trigliceridek elszappanosítását az alkalmazott körülmények között a legjobban gyorsítja (5. faktor). Az alkilszulfát még akkor is hatásos, ha 0,001% (súly per térfogat) mennyiségben adjuk a próbához. 0,1% 35 feletti mennyiségek zavaró habképződést és enyhe gátlást okoznak és ezért általában célszerűtlen üyen mennyiségeket alkalmazni. A találmány szerinti eljárást célszerűen pH 40 6-9 között, előnyösen 7-8,5 között hajtjuk végre. Ennek az az előnye, hogy a képződött glicerin ismert reakciókkal történő meghatározásakor, ATP, GK, PEP, PK, NADH és LDH használatakor, nincs szükség átpufferezésre és a 45 képződött glicerin elszappanosítása és mérése egyetlen reakciólépésben végrehajtható. A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezésénél szérumalbumin - előnyösen marha-szérum- 50 albumin - hozzáadása mellett a kicsapódó szappanok okozta zavarosság biztosan elkerülhető, így nincs szükség az ilyen szappanok leválasztására, például lecentrifugálására. A szérumalbumint célszerűen 0,1-2,0 mg/ml koncentrációban adjuk a 55 próbához. Kobalt- és/vagy magnézium-ionok bizonyos aktiváló hatást mutatnak a lipázzal, illetve észterázzal szemben és ezért a reakció további gyorsítása 60 céljából szintén hozzáadhatok. Pufferként a fent megadott pH-tartományban hatásos minden puffer alkalmas, foszfát-puffer kivételével. Alkalmas puffer például a trietanolarnin-puffer, Tris-puffer, imidazol-puffer, verő 65 nál-puffer, glicin-puffer, továbbá— kevésbé előnyösen — az amediol-puffer, borát-puffer és kollidin-puffer. A találmány szerinti eljárás kivitelezésére szolgáló találmány szerinti reagens a glicerin kimutatására alkalmas rendszerből és kiegészítőén lipázból, karboxilészterázból, az alkilgyökben 10—15 szénatomot tartalmazó alkáli- vagy alkáliföldfém-alkilszulfátból és adott esetben szérumalbuminból áll. A találmány szerinti reagensben glicerin-kimutatásra szolgáló rendszerként elvileg minden hasonló jellegű rendszer alkalmazható. Előnyben részesítjük az olyan rendszert, amely NADH-ból, ATP-ból, PEP-ből, LDH-ból, PK-ból, GK-ból, valamint magnézium-ionokból és pufferből áll. Az utóbbi rendszer jól használható a találmány szerinti elszappanosító szer-kombináció jelenlétében és ezenkívül azzal az előnnyel is jár, hogy az alkotórészek nem zavarják egymást és minden enzim ugyanazon pH-értéknél aktív. Az előnyben részesített reagens-kombináció keretében egy különösen alkalmas reagens a következőkből ál: 0,1-10,0 mg/ml lipáz (Rhizopus arrhizusból) 0,5-20,0 mg karboxilészteráz 0,01-0,2 mg alkilszulfát 1-20 mM NADH 10-100 mM ATP 2-20 mM PEP 0,5-5 mg LDH 0,2-5 mg PK 0,05-10 mg GK 0,1-2,0 mg szérumalbumin 3—20 mM magnézium-ion adott esetben 0,5-1,0 mM kobalt-ion és 0,003-0,3 M 6,9 pH-jú puffer. A fent megadott mennyiségek mindig a megadott koncentrációjú puffer-oldat 1 ml-ére vonatkoznak. A fenti reagensben pufferként előnyösen 0,1 M trietanolamin-puffert (pH 7-8,5) használunk. Mint már említettük, a találmány szerinti eljárás és reagens a triglicerid-meghatározás rendkívüli meggyorsítását és leegyszerűsítését teszi lehetővé. Az elszappanosítási etanolos kálilúggal végző eljárással szemben a meghatározás időtartama több, mint 1 óráról 1/2 óránál kevesebbre csökken. Ugyanakkor számos lépés fölöslegessé válik, így a sok pipettázás, az elszappanosításnál a melegítés, semlegesítés és a csapadék lecentrifugálása. Az enzimatikus elszappanosítási alkalmazó módszerrel szemben az eljárás jelentősen meggyorsul és ugyanakkor a szükséges enzimmennyiség rendkívüli mértékben csökken. A következő példák még jobban megvilágítják a találmányt.