167097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens trigliceridek meghatározására
5 167097 6 1. példa Tárolható reagenst állítunk elő, mely 5 komponensből áll. E komponenseket használat előtt összekeverjük és azután összekevert állapotban 1-2 napig eltarhatjuk. Komponensek összetétel 2,9 ml 1. komponenst, 0,1 ml 2. komponenst és 0,02 ml 3. komponenst elegyítünk és 25 C° melegítjük. Ezután a meghatározandó triglicerideket tartalmazó szérumból 0,1 ml-t hozzákeverünk és 5 percig a megadott hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután hozzákeverünk 0,1 ml 4. komponenst, az elegyet 15—20 percig a megadott hőmérsékleten tartjuk és végül fotométerrel az 35 . extinkciót 366 vagy 340nm-nél leolvassuk. A leolvasott értékeket Ei-gyel jelöljük. Ezután a próbához 0,02 ml 5. komponenst adunk és az extinkciót 10 perc múlva újra leolvassuk. A mért értéket E2 -vel jelöljük. További 10 perc múlva 40 újabb leolvasást végzünk és a mért értéket E3 -mel jelöljük. Értékelés: AE= (E t -E 2 ) - (E 2 -E 3 ) A trigliceridekből összglicerin mg/100ml = =AE.89,1 45 A fenti meghatározást kilencszer megismételtük, miközben a hozzáadott szérum-mennyiséget 0,01 ml-ig csökkentettük. Az így kapott AE értékeket a bemért szérum- 50 -mennyiséggel szemben grafikusan ábrázolva az 1. ábrán bemutatott egyeneshez jutunk. A talált értékekből r=0,9986 értékű arányegyenlőség számítható ki. Az r (ideális)=l,000 értékkel való összehasonlítás az eljárás nagy 55 pontosságát mutatja. 2. példa 60 Az 1. példa eljárását triglicerid-standard oldatot használva megismételjük. Az 1. kísérletben a karboxilészterázt és dodecilszulfátot elhagyjuk. A 2. kísérletben a dodecilszulfátot, a 3. kísérletben a karboxilészterázt 65 hagyjuk el. A 4. kísérletben a teljes reagenst használjuk. A kapott eredményeket, melyek a bemért triglicerideknek a fentebb említett reakcióidő alatti visszanyerését %-ban fejezik ki, a következő táblázat mutatja. Kísérlet Észteráz 1. 0,1 M trietanolamin-puffer 10 pH 7,6, amely mililiterenként 3 mM MgS04 -ot, 1,5 mg marha-szérumalbumint és 0,1 mg nátrium-dodecilszulfátot tartalmaz. 15 2. 6 mM NADH, 33 mM ATP és 11 mM PEP oldata desztillált vízben. 3. 2 mg/ml LDH és 1 mg/ml PK (kereskedelmi) kristályszuszpenziója. 4. 0,2 mg/ml hpáz (Rhizopus arrhizusból) és 1 mg/ml PK oldata. 5. 2 mg/ml GK kristályszuszpenziója. Dodecil Vissza szulfát nyerés % 16 — 24 + 78 + 101 20 25 1 2 3 4 A fenti eredmények az mutatják, hogy a lipáz-koncentráció tekintetében alkalmazott feltételek között csak a találmány szerint használt kombináció alkalmas kvantitatív meghatározás céljára. 3. példa 1. komponens: 30 2-5. komponens: Reakciókeverék: Szérumminta: 0,025 M glikolát-foszfát-puffer, pH 7,0, mely 0,1 mg nátriumdodecilszulfátot és 4mM MgCl2 • 6H 2 O-t tartalmaz, összetétele megegyezik az 1. példában megadottakkal. 2,9 rész 1. komponens komponens komponens komponens. 1 :2 arányban 0,1 rész 2 0,02 rész 3. 0,1 rész 4. A szérumot hígítjuk 0,9% (g/l) vizes NaCl-oldattal. A meghatározást úgy végezzük, hogy 20 jul hígított mintát és lOOOjul reakciókeveréket 15 percig 37 C°-on inkubálunk. Et értékét (extinkció 366 nm-nél) leolvassuk a fotométeren, a reakciót 5/J' 5. komponens hozzáadásával megindítjuk, majd 5 perc után (37 C°) újra leolvassuk az extinkciót (E2). További 5 perc múlva (37 C°) E3 értékét határozzuk meg. Értékelés: A E= fo -E2 ) - (E 2 -E 3 ) A E x 5498= mg semleges zsír/100 ml 4. példa 0,1 ml szérumot 0,4 ml 0,1 M trietanolamin pufferral (pH 7,6), mely mililiterenként 0,1 mg nátrium-dodecilszulfátot és 2 mg lipázt (Rhizopus arrhizusból), valamint 10 mg karboxilészterázt tartalmaz, 15 percen át 37 C° inkubálunk. Ebből a keverékből 0,1 ml-t hozzákeverünk 2,3 ml 0,1 M glicin-nátriumkarbonát-pufferhez, pH 9,0. Hozzáadunk továbbá 0,2 ml 0,05 M foszfát-puffért, pH 7,4, mely mililiterenként 3
