166890. lajstromszámú szabadalom • Eljárás FC-126 pulykaherpesvírus és Marek-betegséget okozó JM GA vírus stabil szuszpenziójának és liofilizátumának előállítására

7 166890 8 A 9. és 10. kísérletben az FC—126 pulykaherpesvírussal megfertőzött csirkeembrió-kötőszövet szuszpenziót (amelyet élő teljes sejtszuszpenzióként —196°C-on fagyasztottunk) felengedni hagyjuk, és a 9. kísérletben 1:30 arányban, míg a 10. kísérletben 1:40 arányban hígítjuk a 3. táblázatban felsorolt szuszpendáló folyadékokkal. A szuszpenzióból 5 ml-es részleteket különítünk el, a folyadékrészleteket 1 percig besugározzuk, majd a folyadékot 1 ml-es részletenként —65°C-on fagyasztjuk vagy liofilizáljuk. Stabilizálószerek és hígítószerek Az első kísérletben a következő oldatokat használjuk fel: 1. 20% glükóz, 2. lefölözött tej stabilizálószer [8% zsírtalan tejpor és 2% NZ amin (AS típus, Sheffield Chemical, Norwich, N. Y.) 6,2 pH-értékű Sörensen-pufferoldattal készített elegye] + 5% glükóz, 3. SPGA stabilizálószer [Bovarnick és mtsai: J. Bact. 59, 509—522 (1950)]. Az elegy 0,218 M szacharózt, 0,0038 M monokálium-foszfátot, 0,0072 M dikálium-foszfátot, 0,0049 M mononátriumglutamátot és 1% porított szarvasmarha-albumint tartalmaz. 4. SPG—NZ amin (az SPGA-hoz|hasonló összetételű stabilizálószer, azzal a különbséggel, hogy szarvasmarha-albumin helyett 1% B-típusú NZ amint (pankreász enzimmel kezelt kazeint) tartalmaz. A különböző oldatok pH-értéke kb. 6,2 és 7,0 között változhat; ismert, hogy ez a pH-tartomány a vírus-faktorra nincs jelentős hatással. A második és harmadik kísérletben további vizsgálatokat végeztünk SPGA stabilizálószerrel. A 4—8. kísérletben kétféle közeget, azaz foszfátpufferolt sóoldatot (PBS, pH = 6,8) és SPGA oldatot alkalmaztunk. A 9. és 10. kísérletben vagy a következő anyagok foszfátpüfferrel (0,0038 M monokálium-foszfát és 0,0072 M dikálium-foszfát) készített oldatait: a) 0,218 M szacharóz (S), b) 0,0049 mononátrium-glutamát (G), c) S és G, d) 1% szarvasmarha-albumin por (A), e) A és S, f) A és G, g) A, G, S, h) 8% zsírtalan tejpor, 2% AS típusú NZ amin (kazein-tartalmú hasnyálmirigy-kivonat, gyártja a Sheffield Chemical cég, 2400 Morris ave, Union, N. J. 07083, USA), i) 8% zsírtalan tejpor, vagy a következő anyagokat használjuk szuszpendálószerként: a) hígítatlan szarvasmarha-magzatszérum (BFS), b) 15% BFS 199 sz. tápoldatban (M199), c) 10% dimetilszulfoxid és 10% triptóz foszfát (20sr. triptóz, 2sr. dextróz, 5sr. nátriumklorid, 2,5sr. dinátriumhidrogénfoszfát) 199 közegben. A liofilizált mintákat az egyes kísérletekben desztillált vízzel rekonstruáljuk. Liofilizálás A liofilizálást Virtis USM—15 Freeze-Dryer készülékben (Virtis Co., Inc., Gyrdiner, N. Y.) végezzük. A mintákat hasított gumidugóval ellátott 5 mles szérumüvegekbe helyezzük, és külön mechanikai fagyasztóban —65 °C-ra előfagyasztjuk, vagy a készülék hűtött polcain —60°C-on megfagyasztjuk. 5 Ezután a szárítópolcokra helyezett mintákat 24 órán át 38°C-on vákuumban szárítjuk"""(közben a szárítópolcokat fűtjük), majd egy további szárítási lépést végzünk kb. 15 órán át, 21 °C-os polchőmérsékleten. Az üvegeket vákuumban ledugaszoljuk, 10 és a vírusvizsgálat végrehajtásáig 4 °C-on tároljuk. A vírusvizsgálatokat a vírusok feldolgozása után 1—10 nappal végezzük. Vírusvizsgálatok 15 Az egyes kísérletekben a mintákat közvetlenül a felengedés vagy^rekonstruálás^után^két 24 órás csirkevese-tenyészetre oltjuk, melyeket a tápközegtől elkülönítettünk. A megfertőzött sejttenyészetekből kivont, Marek-féle megbetegedést okozó 20 JM és GA vírusok esetén egyes esetekben a tenyészethez 0,2% etiléndiamin-tetraecetsavat (EDTA) adunk a vizsgálat érzékenységének fokozása céljából. Az egyes foltok megszámlálását lehetővé tevő mértékű fertőzés biztosítása céljából egyes esetek-25 ben az oltást tízszeres hígításokkal is elvégezzük. Hígítószerként a szuszpendálószerrel azonos közeget használunk. A vizsgálatok során a sejttenyésztést Calnek és mtsai módszerével (J. Nat. Cancer Inst. 45, 341—351 (1970)) végezzük. A fertőzött 30 foltokat a Marek-féle megbetegedést okozó JM és GA vírusok esetén a beoltás után 8 nappal, az FC— 126 pulyka-herpesvírus esetén a beoltás után 6 nappal számláljuk meg. A foltképző egység (FFU) ml hígítatlan vírus érték kiszámításakor a fertőzött fol-35 tok számát két kísérlet átlagértékeként adjuk meg, és a kapott értéket szorozzuk a hígítási tényezővel. Eredmények Az eredményeket az 1., 2. és 3. táblázatban ismer-40 tétjük. Az 1. táblázatban a bőrkivonatokból izolált, Marek-féle megbetegedést okozó JM vírusra kapott eredményeket közöljük. A táblázat adataiból a következőket állapíthatjuk meg: 1. 20%-os glükóz stabilizálószer használatakor a liofilizálást követően 45 a túlélő vírusok száma enyhén, míg SPGA vagy SPG NZ amin stabilizálószer alkalmazásakor nagymértékben növekszik. 2. A nem-liofilizált vírus-szuszpenziók koncentrációja SPGA stabilizálószer hatására több, mint kétszeresére növekszik. 3. A leg-50 nagyobb faktort SPGA-val liofilizált minták esetén kapjuk. A sejttenyészetekből származó vírusokkal végzett kísérletek eredményeit a 2. táblázatban ismertetjük. A táblázat adataiból a következőket állapíthatjuk 55 meg: 1. A Marek-féle megbetegedést okozó mindkét vírustörzs nagyobb koncentrációban vonható ki SPGA szuszpendáló közeggel, mint PBS szuszpendáló közeggel. 2. Az SPGA stabilizálószerrel végrehajtott liofilizálás kitűnő eredményeket ad. 3. Annak 60 ellenére, hogy a sejthez kötött fertőzőképes vírusok koncentrációja azonos, az FC—126 pulyka-herpesvírussal megfertőzött tenyészetekből lényegesen nagyobb hozammal lehet kivonni a vírust, mint a Marek-féle megbetegedést okozó JM és GA vírusok -65 kai megfertőzött tenyészetekből. 4. A PBS-sel ki-4