166816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-hidroxi-3-nitro- kumarin-származékok előállítására
166816 Farmakológiai vizsgálatok A találmány szerint előállított (I) általános képletű 4-hidroxi-3-nitro-kumarin-származékok biológiai hatását patkányon vizsgáljuk, a passzív kután anafilaxis (PCA) módszerrel. A hatóanyagokat nátriumsóik formájában adjuk be. Az oldható nátriumsókat 7,2 pH-értékű pufferoldatban (Sörensenpufferoldat) oldva, míg az oldhatatlan sókat 1%-os metücellulozban szuszpendálva adagoljuk. Patkányok vérszérumában Mota módszerével (I. Mota: Immunology 7, 681 [1964]) hőre érzékeny homocitotróp antitesteket fejlesztünk ki. 250—300 g testsúlyú hím Wistar patkányoknak intraperitoneális injekció formájában 0,5 ml Bordatella pertussis vakcinát (4 x 1010 elölt mikroorganizmus/ ml), és szubkután injekcióban 0,5 ml ovalbuminemulziót (100 mg ovalbumin 2 ml fiziológiás sóoldattal és 3 ml nem-teljes Freund-féle adjuvánssal készített emulziója) adunk be. A 18. napon a patkányokat szívpunktúrával kivéreztetjük, az állatok vérét összegyűjtjük, a vérszérumot elválasztjuk, és —20 °C-on tároljuk. A vérszérumot csak közvetlenül felhasználás előtt hagyjuk felmelegedni. A passzív kután anafilaxis-vizsgálatot Ovary és Bier (A. Ovary és O. E. Bier: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 81, 584 [1952]), valamint Goose és Blair (J. Goose és A. M. J. N. Blair: Immunology 16, 769 [1969]) módszerével végezzük. Az előzőekben kapott vérszérumból 0,9%-os fiziológiás sóoldattal sorozathígítást készítünk (a sorozat egyes tagjait kétszeres térfogatra hígítjuk), és a sorozat 6 egymást követő tagját intradermális úton 250—350 g testsúlyú hím Wistar patkányok borotvált hátbőrének különböző helyeire fecskendezzük. 72 óra elteltével a patkányoknak intravénás injekció formájában 0,3 ml 1%-os ovalbuminoldat és 0,1 ml 5%-os pontamine égszínkék szinezék-oldat elegyét adjuk be (az oldószer mindkét esetben 7,2 pH-jú Sörensen-pufferoldattal pufferolt izotóniás sóoldat). 20 perc elteltével a patkányokat leöljük, és meghatározzuk az antitest-injekciók beadásának helyén kialakult kék korongok átmérőit. A felhasznált szérum-sorozat koncentrációját úgy választjuk meg, hogy a legnagyobb hígítású szérumminta beadásának helyén az ovalbumin-injekció beadása után reakció ne lépjen fel, míg a maximális reakció a két vagy három legkisebb koncentrációjú szérumminta beadásának helyén jelentkezzen. A kísérletben 1 / l és 1/128 közötti hígítású szérummintasorozatot használtunk fel. Megvizsgáljuk, hogy a hatóanyag milyen mértékben csökkenti a kék korongok átmérőit. Csak azokat a korongokat vesszük figyelembe, ahol a reakció mértéke kisebb a maximálisnál. A hatóanyagot meghatározott idővel az intravénás ovalbumin-injekció beadása előtt szubkután úton a patkányok nyakszirtjébe fecskendezzük. Amint már közöltük, a hatóanyagokat Sörensen-pufferoldatban oldva, vagy 1%-os metücellulozban szuszpendálva adjuk be. Minden kísérletben 6 áUatból áüó «soportot vizsgálunk. A hatóanyaggal kezelt állatokon kialakuló kék foltok átmérőit összehasonlítjuk a kontroü-csoportba tartozó áUatokon kialakult foltok átmérőivel. A kontroü-csoportba tartozó 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 áüatoknak az ovalbumin-injekció beadása előtt szubkután úton a kezelt áüatok esetén felhasználttal azonos térfogatú, azonban hatóanyagmentes hordozóanyagot adunk be. A passzív kután anafilaxis százalékos gátlását a következő képlettel számítjuk ki: %-os gátlás = 100 (1—a/b) 10 ahol a = a kezelt áUatokon kialakult kék korongok átlagos átmérője, és b = a kontroll-áüatokon kialakult kék korongok átlagos átmérője. Amint már közöltük, mindkét esetben csak azokat a korongokat vesszük figyelembe, ahol az antigénantitest reakció mértéke kisebb a maximálisnál. Az eredményeket az 1. táblázatban közöljük. 1. táblázat Vegyület Dózis Beadás ideje az oval%-os (példa mg/kg bumin-injekció előtt gátlás száma) (perc) 1. 25 0 90 (Na-só) 100 0 100 25 30 45 100 30 59 2. 25 0 88 100 0 63 25 30 19 100 30 17 3. 25 0 73 (Na-só) 100 0 74 25 60 38 100 60 34 4. 25 0 81 25 30 41 5. 25 0 82 (Na-só) 25 30 36 6. 25 0 47 100 0 76 25 30 38 50 30 31 A hatóanyagokat előnyösen 7,2 pH-értékű pufferoldattal készített, nátriumhidrogénkarbonáttal semlegesített oldat formájában adjuk be. Oldhatatlan nátriumsót képező vegyületek esetén először a szabad nitro-vegyületet 2,5 n nátriumhidroxid-oldattal reagáltatjuk, a kivált nátriumsót leszűrjük, vízzel lúgmentesre mossuk, szárítjuk, majd 1%-os metilceüulózban szuszpendálva adjuk be. 4
