166652. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(tien-2-IL-acetilamino)-3-acetoximetil-CEF- 3-ÉM-4-karbonsav enzimes előállítására

3 166652 4 nitrogénforrásokat, például peptont, húskivonatot, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, szárított élesztőt, nitrátot, ammóniumsót vagy hasonlókat; szénforrásokat, például melaszt, glukózt, keményítőhidrolizátumot és hasonlókat, valamint szervetlen sókat és kívánt esetben növekedést elősegítő anyagokat tartalmazó folyékony táptalajban 25—37 C°-on, 12—60 óra alatt aerób módon tenyészthető. Ipari előállítás esetén általában süllyesztett aerób tenyésztés alkalmazható. A 7-ACA aminocsoportjának acetilezésére szolgáló enzim rendszerint exo-enzimként van jelen. Az enzimes reakcióban enzimkészítményként mikroorganizmus-tenyészet, fermentlészüredék vagy abból előállított enzim használható. A találmány szerinti eljárásban ezenkívül kémiai vagy fizikai eljárásokkal kezelt fermentlészüredéket, például ismert elválasztó és tisztító eljárásokkal — mint amilyen a kisózás, frakcionált kicsapás, dialízis, adszorpciós kromatográfia, ioncserélő kromatográfia vagy a fermentlészüredék gélszűrése — kapott enzimkészítményeket is használhatunk. Szilárd fázisú enzimkészítmények vagy az acilező enzimnek olyan iners hordozón való adszorbeálta tásával előállított oldhatatlanná tett enzimek is alkalmazhatók, amely a szubsztrátumot és az acilező enzimet nem inaktiválja. Az acetilezést úgy hajtjuk végre, hogy 7-ACA-t acilező enzim vagy enzimkészítmény jelenlétében tienilecetsavval vagy annak egy származékával reagáltatjuk. Rendszerint szabad, savas 7-ACA-t használunk 0,1— 20 mg/ml, előnyösen 2—5 mg/ml koncentrációban. A tienilecetsav szabad sav alakjában szubsztrátumként nem hatékony, ezért ennek valamely hatékony származékát, például egy kevés szénatomos alkohollal, előnyösen metanollal képzett észterét használjuk. A tienilecetsav-származékot a 7-ACA-hoz viszonyítva általában 2—20 mólos feleslegben használjuk, a legelőnyösebb az 5—10 mólos felesleg. A reakció hőmérséklete rendszerint 30 és 45 C°, előnyösen 35 és 40 C° között van. A reakciókeverék pH-ját előnyösen 7—8 értéken tartjuk. A reakció időtartama a reakciókörülményektől függően 1 és 10 óra között változhat, és akkor fejezzük be, amikor a legnagyobb cefalotintermelést elértük. Szilárd fázisú enzimkészítmény jelenlétében való acetilezésre az acilező enzimet előbb hordozón adszorbeáltatjuk. Az acilező enzimet úgy adszorbeáltatjuk, hogy az acilező enzimet termelő törzs tenyészetének szüredékét adjuk hozzá a hordozóanyaghoz. A találmány szerint használt hordozókat az enzimet adszorbeáló hordozók tulajdonságai figyelembevételével választjuk ki azok közül, amelyek nem inaktiválják az acilező enzimet, amelyekről az adszorbeált enzim mosással nem távolítható el, amelyek inersek minden szubsztrátummal szemben, és a cefalotint nem adszorbeálják. A vizes enzimoldat adszorbeáltatására előnyösen használható hordozó például az aktív alumíniumoxid, kovaföld, aktív agyag, kalciumfoszfát, hidroxiapatit és hasonlók. Amikor az enzimet hordozóval adszorbeáltatjuk, ajánlatos először az acilező enzim pH-ját állandóra beállítani. Az adszorbeáltatás műveletét adagonként vagy oszlopon végezhetjük, az utóbbi a folyamatos enzimreakció számára előnyös. A hordozóanyag mennyisége a fermentlé szüredékének térfogatától, az enzim hatóképességétől és a hordozóanyag adszorpcióarányától függően változik. Az adagonkénti adszorpció esetében általában a hordozóanyag mennyisége a fermentlé szüredékének .5—15%-a. Az oszlop alkalmazása esetében a hordozóval töltött oszlopot vízzel vagy az enzim számára legkedvezőbb pH-jú puíTeroldattal nedvesítjük, a fermentlét vagy az enzimoldatot átvezetjük az oszlopon, majd az oszlopot vízzel vagy puíTeroldattal mossuk. Ha az adszorbeált acilező enzimet tartalmazó hordozó, vagyis a szilárd fázisú enzimkészítmény túlságosan szárazzá válik, denaturálódik, vagy elveszti aktivitását. Ezért nedvesen kell tartani. Ezután a 7-ACA-t szilárd fázisú enzimkészítmény jelenlétében tienilecetsavval vagy annak egy származékával reagáltatjuk. Mivel a szubsztrátum koncentrációja főleg az enzim hatóképességétől vagy az oszlopon való átfolyási sebességétől függően változhat, előnyös a koncentrációt úgy beállítani, hogy az eluátumban ne legyen reagálatlan 7-ACA vagy tienilecetsav. Az acilező reakciót az enzim aktivitása számára legkedvezőbb pH-nál és hőmérsékleten kell végrehajtani. A reakció időtartamát az oszlop típusú működés esetén a szubsztrátum kifolyó mennyiségének változtatásával lehet beállítani. A reakciót rendszerint a szilárd fázisú enzimkészítmény oszlopon való átvezetésével lehet végrehajtani, és a folytonos üzem a szubsztrátum folyamatos hozzáadásával könnyen megvalósítható. Ha azonban az eluátumban szubsztrátum található, akkor a kifolyás sebességét csökkenteni kell, vagy az eluátumot újra át kell vezetni az oszlopon. Ezeket a folyamatokat önműködően szabályozott üzemi rendszerként lehet kialakítani. Amikor az enzimaktivitás csökken vagy megszűnik, a működést természetesen be kell fejezni. A keletkezett cefalotint ismert elválasztó módszerekkel különítjük el. A cefalotintartalom meghatározása A cefalotint tartalmazó vizsgálandó oldatot mikrobiológiailag papírkorong-módszerrel vagy csészemódszerrel határoztuk meg, és a meghatározásra Bacillus subtilis PCI—219 törzset 16 óra hosszat 37 C°-on tenyésztve alkalmaztunk. A keletkezett gátlási zóna a cefalotin hatékonyságának mértékéül szolgált, és a cefalotin hatásgörbéjével összehasonlítva számítottuk ki. A következő példák közelebbről szemléltetik a találmányt. A hőmérsékleti adatokat Celsius-fokban fejezzük ki. 1. példa 1% polipeptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó 7,0 pH-jú 100 ml vizes táptalajt 500 ml-es lombikban 20 percig 120°-on sterilizálunk. A táptalajt Bacillus megaterium NRRL B—5385 törzsbe beoltjuk, és 48 óra hosszat 30°-on rázás közben inkubáljuk. A fermentlé szüredékének pH-ját 7,5-re állítjuk be, hozzáadunk 1 g kovaföldet, és 30 percig keverjük. A szűrőn elválasztott hordozót 0,1 mólos 7,5 pH-jú foszfátpufferral mossuk, majd hozzáadjuk 2,5 ml 0,5%-os 7-ACA vizes oldat, 2,5 ml 2-tienilecetsavas metilészter és 7,5 ml 0,1 mólos 7,5 pH-jú foszfátpuffer keverékét, és 37°-on 30 percig keverjük. A reagálás után a hordozót elválasztjuk, a szüredéket kovasavgélvékony-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2