166652. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(tien-2-IL-acetilamino)-3-acetoximetil-CEF- 3-ÉM-4-karbonsav enzimes előállítására
5 166652 6 réteges lemezen kromatografáljuk, és a kifejlesztésre benzol, aceton és ecetsav 40 : 56 : 4 arányú keverékét használva a cefalotin hiteles mintájával azonos egyetlen foltot kapunk. Rf értéke 0,54. A cefalotinképződés aránya 75%. 2. példa Az 1. példa szerinti eljárással kapott 4 liter fermentlészüredék pH-ját beállítjuk 7,5-re, 40 g kovaföldet adunk hozzá, és 30 percig keverjük. A kapott készítményt külső köpennyel ellátott 2 cm átmérőjű oszlopba töltjük, 0,1 mólos 7,5 pH-jú foszfátpufferral mossuk, és 30 perc alatt átfolyatunk rajta 0,25% 7-ACA-t és 2,5% 2-tienilecetsav-metilésztert tartalmazó 480 ml 0,1 mólos 7,5 pH-jú foszfátpuffert. Az eluátumot térfogatának 1/10-ére bepároljuk, pH-ját beállítjuk 2 értékre, és etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos réteget vízzel és telített vizes nátriumklorid-oldattal mossuk, és vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk. Szűrés után a szüredékhez 3 ml 30%-os etilacetátos nátrium-2-etilhexanoátoldatot adunk, majd jéggel hűtjük, mire a termék nátriumsója kicsapódik. A csapadékot etilacetáttal mossuk, és szárítjuk. Kitermelés i,0 g. A termék infravörös spektruma azonos a cefalotin nátriumsója hiteles mintájának infravörös spektrumával. 3. példa 1% glukózt, 1% peptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmazó, 7,0 pH-jú 600 liter folyékony táptalajt beoltunk Bacillus megaterium NRRL B—5385 törzs 30 liter oltótenyészetével, és levegőztetés közben, 26°-on 72 óra hosszat süllyesztve inkubáljuk. A fermentálás után a tenyészetet centrifugálva 580 liter szüredéket kapunk. A szüredék pH-ját beállítjuk 7,5-re, majd 6 kg kovaföldet adunk hozzá, és 40 percig keverjük. Az enzimet adszorbeált hordozót külső köpennyel ellátott 12 cm átmérőjű oszlopba töltjük, az oszlopot 7,5 pH-jú 0,1 mólos foszfátpufferrel mossuk, és 1 kg 7-ACA (10 mg/ml), 15 liter 2-tienilecetsavas metilészter és 100 liter 0,1 mólos, 7,5 pH-jú foszfátpuffer keverékét tartalmazó oldatot vezetünk át rajta 0,5 fajlagos sebességgel. Az eluátumot kétszer 20 liter etilacetáttal mossuk, és a kovaföldoszlopot 15 liter etilacetáttal mossuk. Az etilacetátos réteget kiontjuk, és a vizes réteg pH-ját 6n sósavval 1—2 értékre állítjuk be. Ezt a vizes réteget 20 liter etilacetáttal kétszer mossuk, és vákuumban bepárolva 1,86 kg nyers cefalotint kapunk. Tisztasága 80%. Az összes kitermelés 96%. A nyers terméket átkristályosítva 1,34 kg 98% tisztaságú kristályos anyagot kapunk. Kitermelés 85%. 5 Az oltótenyészet úgy készül, hogy 100 ml vizes közeget, amely 1% polipeptont, 1% húskivonatot és 0,5% nátriumkloridot tartalmaz, és a pH-ja 7,0, egy 500 ml-es lombikban 20 percig 120°-on sterilizálunk, majd beoltjuk Bacillus megaterium NRRL B—5385-tel, és 30°-on 10 30 óra hosszat rázatjuk. A kapott tenyészettel aszeptikusán beoltunk 30 liter azonos összetételű táptalajt egy 50 literes fermentorban, és 24 órán át 30°-on percenként 30 liter levegőztetéssel fermentáljuk. 15 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 7-(tien-2-il-acetamino)-3-acetoximetil-cef-20 -3-ém-4-karbonsav előállítására azzal jellemezve, hogy 7-amino-3-acetoximetil-cef-3-éni-4-karbonsavat a Bacillus megaterium NRRL B—5385 mikroorganizmus által vizes táptalajban termelt, adott esetben oldhatatlanná tett, előnyösen a fermentléből vagy szüredékéből hordo-25 zóanyagra adszorbeált, a 7-amino-3-acetoximetil-cef-3--ém-karbonsav aminocsoportját acilező enzim jelenlétében egy 2-tienilecetsav-(l—4 szénatomos)-alkilészterrel reagáltatunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási mód-30 ja azzal jellemezve, hogy acilező enzimként Bacillus megaterium NRRL B—5385 fermentlét, vagy annak szüredéket használjuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy acilező enzimként oldhatatlan-35 ná tett enzimkészítményt használunk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy oldhatatlanná tett enzimkészítményként Bacillus megaterium NRRL B—5385 fermentléből vagy annak szüredékéből hordozóanyagra 40 adszorbeált acilező enzimet használunk. 5. Az 1. vagy 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy hordozóként kovaföldet, aktív agyagot, alumíniumoxidot, kalciumfoszfátot vagy hidroxiapatitot használunk. 45 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a reakciót 35—40 C°-on, 7—8 pH-n, 0,1—20 mg/ml koncentrációjú vizes 7-amino-3--acetoximetil-cef-3-ém-4-karbonsav-oldatot és a 7-amino-3-acetoximetil-cef-3-ém-4-karbonsavra számítva 5— 50 10 mólos feleslegben levő 2-tienilecetsavésztert használva hajtjuk végre. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 76.2787.66-42 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkő István igazgató
