166646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-CEF-3-EM-4-karbonsav és észtereik előállítására

5 166646 6 3. Megvizsgáljuk, hogy a kapott oldat abszorpciója 260 mjjL-nál eléri-e a reakció előtti elegy abszorpciójának 20%-át? A mindhárom vizsgálatra pozitív választ adó mikroorganizmusok alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásban. Kísérleteink során mind az A eljárás, mind a B eljárás lényegileg azonos eredményt mutatott ugyanazon mikroorganizmus használhatóságára vonatkozóan. A szubsztrát említett reakcióját a táptalajjal vagy kezelt anyagával olymódon végezhetjük, hogy a mikroorganizmust a szubsztrátot tartalmazó tenyésztő közegben tenyésztjük, ha az organizmus toleráns a szubsztráttal szemben. Sokkal általánosabb azonban az ilyen mikroorganizmust a megfelelő módon tenyészteni és a kapott tenyésztőközeget vagy kezelt anyagát felhasználni. A tenyésztést keverés mellett levegőztetéssel, rázassál vagy anélkül végezzük, de mindenképpen az aerob tenyésztés ajánlatos. A tenyésztő közeget az összetevők kiválogatásával önmagukban vagy kombinálva a kívánalmaknak megfelelően készítjük, húskivonatból, élesztőkivonatból, peptonból, kazein hidrolizátumból, kukoricalekvárból, burgonyaléből vagy más általánosan használt természetes anyagból; szénvegyületekből, mint cukrokból, szerves savakból vagy normál paraffinokból; különböző szervetlen és szerves nitrogéntartalmú vegyületből amino vagy nitrát alakban; foszfátokból, magnéziumsókból, konyhasóból, vagy más fémionokat tartalmazó anyagokból és különböző vitaminokból. A szubsztrát acil-csoportjának megfelelő fenoxiecetsav vagy fenilecetsav 0,05—1% koncentrációban való hozzáadásával növelhetjük a tenyésztő közeg aktivitását. A tenyésztő közeg pH-ja és a tenyésztés hőmérséklete a mikroorganizmustól függ. A kívánatos pH azonban általában 5 és 8 közt van gombák és élesztők esetén és 6 és 9 érték közt baktériumok és Actinomyces-ek esetén. A tenyésztést 10 C° és 40 C° közötti hőmérsékleten végezzük. Az az idő, amikor az említett aktivitás eléri a maximumot, függ az alkalmazott mikroorganizmustól, így a tenyésztés optimumát kívánatos minden törzsre meghatározni. Az így nyert táptalaj vagy kezelt anyaga felhasználható 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav vagy észtere előállítására. A táptalaj kezelésén az említett átalakító aktivitás felszabadítására vagy koncentrálására végzett, a kívánt vegyület előállítása szempontjából előnyös, kívánatos kezeléseket értjük. Ha az említett aktivitás főleg intracelluláris, például (1.) elkülönített sejtek különböző koncentrációjú sejtszuszpenziója pufferekben, (2.) szokásos módon előállított sejtmentes sejtkivonatok, (3.) tisztított vagy részlegesen tisztított, az említett sejtmentes kivonatokból a szokásos módon (I.C. Gunsalus, ill. CS. French és mt. módszere S.P. Colowick és N.O. Kaplan: „Methods in Enzymology" New York, 1955, I. kötet, 51. és 64. oldal) előállított enzimoldatok előnyösen alkalmazhatók. Ha az említett aktivitás főleg extracellulárisan mutatható ki, (1.) a táptalajból a sejtek vagy a micéliumok eltávolításával kapott felülúszó, (2.) a szokásos módon (A.A. Green, S.P. Colowick és mt., R..R. Poster és mt., illetve C.H.W. Hirs módszere, S.P. Colowick és N.O. Kaplan: „Methods in Enzymology", New York, 1955, I. kötet, 67., 90., 98. és 113. oldal, valamint H. Determann: „Gel Chromatography", New York, 1969) tisztított vagy részlegesen tisztított, az említett felülúszóból előállított enzimoldatok használhatók. A szubsztrát és az így előállított táptalaj vagy kezelt anyaga közti reakciót vízben vagy más vizes közegben hajtjuk végre. A reakcióelegy pH-ját kívánatos 4 és 9 között, közelebbről 6 és 8 között tartani. A kívánatos 5 reakcióidő függ a szubsztrát koncentrációjától, a reakció hőmérsékletétől és egyéb tényezőktől, de általában 1—24 óra elegendő. A reakció hőmérséklete 10 C° és 50 C° között, előnyösen 15 C° és 40 C° között változik. A szubsztrát koncentrációját főleg a kívánt ve-10 gyületté történő átalakítás aktivitása határozza meg, de általában 0,1 és 5% (súly/térfogat) közt változik a kiindulási anyagra és a közegre nézve. A 7-ammo-3-metil-3-cefem-4-karbonsav vagy észtere 15 a szokásos eljárások, mint az oldószerrel végzett extrakció vagy kromatográfia kombinálásával enyhe körülmények között elkülöníthető és tisztítható. Különösen ajánlatos a reakcióelegy szűrletét Amber-20 lite XAD—2 oszlopon kromatografálni, és így a vízzel eluált frakciók tartalmazzák a kívánt terméket. A találmányt az alábbi példákkal világítjuk meg az oltalmi kör korlátozása nélkül. A példákban az előző-25 ékhez hasonlóan a „mm", „ml", „mg", „g", „M", „N" rövidítések millimétert, millilitert, milligrammot, grammot, mólkoncentrációt, normalitást jelentenek; a táptalaj összetételére vonatkozó százalékos adatokat súly/térfogat alapon adtuk meg, mint gramm/deciliter; 30 a százalékos oldatok máskülönben súly százalékot jelentenek, hacsak másként nem jelöljük. A súlyrész arány azonosnak vehető a térfogat aránnyal, ha a gramm azonos a milliliterrel. A táblázatokban a „—" jel azt jelöli, hogy a termék nem észlelhető, A megfelelő fajnevekhez 35 kapcsolódó IFO és ATCC számok az Institute for Fermentation, Osaka, Japán és American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A. egyezményes számai és az említett törzsek a találmány bejelentése előtt megtalálhatók voltak a megfelelő tenyésztő gyűjtemények-40 ben, kivéve a következőket, melyek nincsenek felsorolva közleményekben, de az American Type Culture Collection-ben a következő számok alatt vannak deponálva. Escherichia coli IFO—3210: ATCC—21758 45 Escherichia coli IFO—3467: ATCC—21753 Xanthomonas oryzae IFO—3312: ATCC—21754 Protaminobacter alboflavus IFO—13221: ATCC—21755 Mycoplana sp. IFO—13240: ATCC—21756 50 Aeromonas hydrophila IFO—12634:ATCC—21757 Mivel a Mycoplana sp. IFO—-13240 fajai még nincsenek meghatározva, a törzs jellemzőit a következőkben írjuk le: 55 0,6 JJ. átmérőjű, 2—6 \i hosszú szabálytalan pálca, néha görbült, nagyon fiatalon elágazó. Poláris ostorral mozog. Gram-negativ. Aerob. Agar telepek: körkörös, halványszürke, domború sima, 60 teljes. Ferde agar: levélalakú, halványszürke, sima. Táptalaj: zavaros. Zselatin pálca: elfolyósodik. Vékony felszíni növekedés. 65 Kazein, keményítő és cellulóz nem hidrolizálódik. 3