166646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-CEF-3-EM-4-karbonsav és észtereik előállítására

166646 A nitrátból nem termelődik nitrit. Hidrogénszulfid nem termelődik. Indol nem termelődik. Metilvörös vizsgálat: negatív. Kataláz: pozitív. 5 Lakmusz: változatlan. Burgonya: nincs növekedés. Szénhidrát közegben nincs, vagy csak csekély a növekedés. Aromás vegyületek, mint fenilglicin, felhasználódnak. 10 Izolálás a talajból. 1. példa 15 Két napos Escherichia coli IFO—3210 inokulumból 5 térfogatrészt 200 térfogatrész pH =7,2 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont, 0,5% nátrium-glutamátot, 0,5% 20 nátrium-kloridot és 0,05% fenilecetsavat tartalmazó tenyésztőközegbe oltunk. A tenyésztőközeget 37 C°-on rázás közben 48 órán át inkubáljuk, majd 0,8 súlyrész 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-metilészter 8 térfogatrész acetonnal és 50 térfogatrész pH = 25 7,0, 0,25 M foszfát pufferrel készült oldatát adjuk hozzá. Az egész reakcióelegyet 28 C°-on 16 órán át rázzuk, mialatt a 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-metilészter teljesen eltűnik a reakcióelegyből és 0,4 súlyrész 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav ke- 30 letkezik. Hozam: 81%. A reakcióelegyet leszűrjük a sejtek eltávolítása céljából, a szűrletet a fentiek szerint Amberlite XAD—2 oszlopon kromatografáljuk eluensként desztillált vizet 35 alkalmazva, és így 0,35 súlyrész (71%) 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat kapunk, mely 240—242 C°-on olvad bomlás közben. 40 2. táblázat 2. példa A 2. táblázatban felsorolt baktériumtörzsek mind- 45 egyikével 200 ml 7,2 pH-jú tápoldatot oltunk be, amely 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont, 0,5% nátrium-L-glutamátot, 0,5% nátriumkloridot és 0,05% fenilecetsavat tartalmaz. A beoltott tápközeget 48 órán át inkubáljuk 28 C° hőmérsékleten. A tápoldat 200 ml-éhez 50 800 mg 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-metilészter (1. szubsztrát) 8 ml acetonnal és 50 ml 0,25 M foszfát pufferrel (pH = 7,0) készült oldatát adjuk. Emellett minden táptalaj másik 200 ml-éhez 800 mg 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav 55 (2. szubsztrát) 50 ml 0,25 M foszfát pufferrel (pH =7,0) készült oldatát adjuk. A reakcióelegyeket ezután 28 C°on 16 órán át rázzuk, a reakció végbemenetele érdekében. A termékeket elkülönítjük a reakcióelegyből és oszlopkromatográfiával tisztítjuk. A kitermelést a 260 60 mfA-nál mért abszorpcióval határozzuk meg, ahogy azt a 2. táblázat mutatja, ahol az A termék: 7-amino-3-metil-3-cefem-4-karbonsav-metilészter; B termék: 7-amino-3-metil-3-cefem-4-karbonsav. 65 1. szubsztrát 2. szubsztrát Mikroorganizmus A B B termék termék termék mg Escherichia coli IFO—3467 400 420 Xanthomonas oryzae IFO—3312 — 350 300 Xanthomonas malvacearum IFO—3383 — 380 350 Bacillus pumilus IFO—12093 — 140 380 Bacillus licheniformis IFO—12199 — 80 390 Pseudomonas solanacearum IFO—12510 — 110 250 Protaminobacter alboflavus IFO—13221 — 140 370 Mycoplana sp. IFO—13240 — 370 250 Aeromonas hydrophyla IFO—12634 150 — 300 3. példa A 3. táblázatban felsorolt baktérium törzsek mindegyikéből egy oltókacsnyit 5 ml, pH = 7,0 0,8% „Bacto—Nutrient, dehidratált táptalaj"-t (általánosan alkalmazott, Difco Laboratories által gyártott, USA) és 0,3% fenilecetsavat tartalmazó vizes közegbe oltunk és 28 C°-on 24 órán át rázás közben tenyésztjük. A táptalajhoz 30 mg 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4--karbonsav (1. szubsztrát) 1 ml 0,24 M pH =7,0 foszfát pufferrel készült oldatát adjuk. A rázást 28 C°-on 4 órán át folytatjuk az 1. szubsztrát esetén és 24 órán át a 2. szubsztrát esetén, mindaddig, míg a reakcióelegy nem mutat antimikrobiális aktivitást. A reakcióelegyben levő kiindulási szubsztrátumok ugyanis, mint azt az eljárás során használható mikroorganizmus törzsek vizsgálatára szolgáló B eljárás ismertetésében részleteztük, antibakteriális aktivitást mutatnak, pl. a Bacillus subtilis PCI—219 törzzsel szemben, míg a reakció előrehaladása közben a reakcióelegy antibakteriális aktivitása csökken, és jelzi a reakció előrehaladását. Ez azt jelenti, hogy a szubsztrátok teljesen átalakultak. A 7--amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav kitermelését a fenilacetil-kloriddál történő fenilacetilezés után visszanyert antimikrobiális aktivitás mérésével állapítjuk meg. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be. 3. táblázat Mikroorganizmus szubsztrát 2. szubsztrát Escherichia coli IFO—3210 18 15 Escherichia coli v. communior IFO—3550 17 14 Bacillus sp. ATCC—14552 18 14 Bacillus pumilus IFO—12093 16 13 4