166646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-amino-3-metil-CEF-3-EM-4-karbonsav és észtereik előállítására
3 166646 4 Coniochaeta, Chaetomium, Chrysosporium, Cephaloascus, Diaporthe, Daedaleopsis, Dactylaria, Emericellopsis, Fusarium, Griphosphaeria, Gibberella, Glomerella, Isaria, Microascus, Neurospora, Pestalotiopsis, Pyrenophora, Pseudoples, Papularia, Pleospora, Pellicularia, Rosellinia, Septoria, Sclerotium, Sartorya, Trichometsphaeria, Taphrina, Talaromyces, Verticillium, Nocardia, Streptomyces, Escherichia, Bacillus, Xanthomonas, Pseudomonas, Protaminobacter, Mycoplana, Aeromonas, Acetobacter, Rhodotorula, Cryptococcus, Nadsonia, Saccharomycedes és Saccharomyces nemzetségekbe tartozók. A találmány szerinti eljárás alapján a 7-fenilacetamido- vagy 7-fenoxiacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavat vagy alkil-, alkiltioalkil-, alkilszulfenilalkil-, halogénalkil- vagy aralkil-észterét az említett mikroorganizmusok tápoldatával, vagy a tápoldatból kinyert mikroorganizmusokat tartalmazó anyaggal reagáltatjuk vizes közegben. A szubsztrátként használt kiindulási vegyület 7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav, 7-fenoxi-acetamino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav vagy ezek észtere. Ezeket a vegyületeket előállíthatjuk például a megfelelő 6-acilamidopenicillánsav észterekből azok S-oxidjain át a 3 275 626 sz. USA-beli szabadalmi leírás vagy a 747118 számú belga szabadalmi leírás szerint. A kiindulási vegyület alkalmazható szabad sav vagy nátrium-, kálium-, ammónium-, amin- vagy más só alakjában. A kiindulási anyag lehet elkilészter, például metil-, etil-, butil-, vagy hexilészter, szubsztituált alkilészter, például metiltiometil-, metilszulfenilmetil-, metilszulfonilmetil-, klórmetil-, brómmetil- vagy triklóretilészter; vagyis a szubsztituens lehet alkiltio-, alkilszulfenil-, alkilszulfonil-csoport, vagy halogén atom, továbbá aralkilészter, például benzil-, vagy fenetilészter vagy más észter. Az említett mikroorganizmusokat az általános gyakorlatban elérhető tenyészetekből, vagy a talajból, szennyvízből, tengervízből, virágokból, gyümölcsökből, levegőből és más forrásból a szokásos módon elkülöníthetjük [T.H. Lord: Determinative Bacteriology (Burgess Publishing Co., Minnesota, USA, 1962.)]. Kísérleteink szerint a használatos mikroorganizmusok említett elkülönítése például a következő eljárások szerint végezhető el. A eljárás A felsorolt törzsek mindegyikét 2 ml vizes közegben, aerob viszonyok mellett, az 1 táblázatban feltüntetett körülmények között tenyésztjük annak megfelelően, hogy baktérium, Actinomyces, gomba vagy élesztő törzsről van-e szó. A tenyészethez 20 mg szubsztrát (7-fenilacetamido- vagy 7-fenoxiacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-metilészter 0,4 ml acetonnal készült oldatát adjuk, és a reakcióelegyet 28 C°-on 16 órán át rázzuk. A kapott reakcióelegy kis részét, mintegy 0,01 ml-t vékonyrétegű szilikagélen, 1: 2 térfogatarányú metanol-aceton eleggyel futtatva kromatografáljuk 10 cm hosszan. A kromatogramot UV fénnyel megvilágítva a lényeges foltok láthatóvá válnak. A fenti specifikus körülmények között a szubsztrát és a termékek megfelelő Rf értékei előzetesen meghatározhatók; így például: 1. táblázat Mikroorganizmus Tenyésztő közeg összetétele Tenyésztés Baktérium 1% húskivonat, 1% pepton, 0,5% L-glutaminsav mono-nátrium sója, 0,05% fenilecetsav (vagy fenoxiecetsav), pH = 7,2 28—37 C° 1—2 nap Gomba vagy Actinomyces 3% szacharóz, 0,2% NaNOs , 0,1% K2 HP0 4 , 0,05% KCl, 0,05% MgS04.7H 2 0, 0,01% FeS04 .7H 2 0, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% pepton, 0,5% kukoricalekvár, 0,05% fenoxiecetsav (vagy fenilecetsav), pH =6,0 28 C° 4 nap Élesztő 5% szaharóz, 0,025% KH2 P0 4 , 0,1% CaN0 3 , 0,025% MgS04 .7H 2 0, 0,01% KCl, pH =6,0 28 C° 2 nap 25 0,86 a 7-fenilacetamido- vagy 7-fenoxiacetamido-3--metil-cef-3-em-4-karbonsav-metilészterre, 0,65 a 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav-metilészterre, 0,42 a 7-amino-3-metil-cef-3-em-4-karbonsavra. 30 így a fenti példában a 0,65 és/vagy a 0,42 Rf értéknél foltot adó reakcióelegyeket kiválogatjuk és sztirol-divinilbenzol kopolimer gyantával töltött, mintegy 10 mm átmérőjű, 100 mm hosszúságú oszlopon (a kereskedelemben rendelkezésre álló „Amberlite XAD—2", 35 Rohm & Haas Co., U.S.A.) engedjük át. A 40 ml vízzel eluált frakciókat összegyűjtjük és a termék teljes menynyiségét 260 mjj,-on mért UV abszorpció alapján határozzuk meg. Ha a mérések szerint a kitermelés az alkalmazott szubsztrátra számítva 10% vagy magasabb, 40 a vizsgált mikroorganizmus alkalmasnak tekinthető a találmány szerinti eljáráshoz. B eljárás 45 A felsorolt törzsek mindegyikéből hasonló módon tenyészetet készítünk. A táptalaj 5 ml-éhez 50 mg szubsztrát (7-fenilacetamido-3-metil-cef-3-em-4-karbonsav) 1 ml 0,25 M foszfát pufferrel (pH = 7,0) készült 50 oldatát adjuk. A reakcióelegyet 28 C°-on 16 órán át rázzuk. A kapott reakcióeleggyel a következő három vizsgálatot végezzük el: 1. A kapott reakciótermék Bacillus subtilis PCI—219-vel szemben mutatott antibakteriális aktivitásának 55 a reakció kezdetéhez viszonyítva 80%-ra vagy kevesebbre történő csökkenését Higgins és munkatársai [Antibiotic and Chemotherapy, 3, 50—54 (1953)] és Loo és munkatársai [Journal of Bacterology, 50, 701—709 (1945)] megfelelően módosított korong-lemez eljárásá-60 val vizsgáljuk. 2. A kapott reakcióelegy antibakteriális aktivitásának fenilacetilkloriddal történő fenilacetilezés hatására történő fokozódását Batchelor és munkatársai eljárása szerint módosítva [Nature, 183, 257—258 (1959)] vizs-65 gáljuk. 2
