166530. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antipepszin hatású pepsztrationok előállítására
5 166530 6 (ID50 értékkel) rendelkezik. A termék.bomláspontja 250—251 C°, forgatása (a)g, = -90° (c + 1,0 ecetsav). A termék több, mint 80% pepsztatin B metilésztert tartalmaz (Rf = 0,39 a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat során). Elemi összetétele a C36 H 67 N 5 0 9 képletre számított: C 60,6% H 9,40% N 9,82%; talált: C 60,4% H 9,38% N 9,74%. 2. példa 3100 g 1. példa szerint előállított új pepsztatin-származék metilésztert feloldunk 130 liter 0,2 N töménységű 90% metanolt és 10% vizet tartalmazó nátrium-hidroxid-oldatban, majd az elegyet az észter elszappanosítására 2 órán keresztül 60 C°-on melegítjük. A fenti idő után a reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, a kapott sűrű párlási maradékot 20 liter n-butanollal telített vízben oldjuk, az oldathoz 15 liter vizet adunk hozzá és az elegy pH-ját híg kénsavval 3,0 értékre állítjuk be. 20 percnyi keverés után a fázisokat elválasztjuk, a 18 liter térfogatú felső butanolos fázist 270 liter vízbe csepegtetjük, a kivált csapadékot 60 percen keresztül keverjük, szűrjük és vízzel mossuk. A mosott csapadékot vákuumban megszárítva 2500 g súlyú fehér port kapunk. A por bomláspontja 205—210 C°, forgatása (a)g = -840 (c = l,0 metanol). A termék antipepszin-aktivitása, ID50 = 0,055 y. (Az ID50 a pepszinre 50%-os gátló hatást kifejtő hatóanyagmennyiség). A titrálási görbe alapján 700 mg minta 9,7 ml 0,1 N nátriumhidroxid-oldatot fogyaszt. Elemi összetétele a C3 5H 65 N 5 0 9 képletre: számított: C 60,05% H 9,36% N 10,00% 0 20,57%; talált: C 60,15% H 9,30% N 10,11% O 20,49%. 3. példa 100 g 1. példában ismertetettek szerint előállított új pepsztatin-származék metilésztert feloldunk 4 liter abszolút metanolban, majd a metanolos oldatot 20 g aktívszénnel derítjük. Az oldatot éjszakán át állni hagyjuk. Másnap a kivált 24 g fehér kristályt szűréssel elkülönítjük, a metanolos anyalúgot 1,3 literre töményítjük, a kivált csapadékot 60 percen keresztül 60 C°-on keverjük, majd az elegyet szűrjük. Szűrés után az anyalúgot éjszakán át kristályosítva 5,5 g súlyú második generációt kapunk. A második generációt alkotó fehér kristályokat 1,5 liter forró metanolban oldjuk, az oldatot csontszénriel kezeljük, majd éjszakán át állni hagyjuk. Ilyen módon másnap 12,0 g súlyú harmadik generációt kapunk. A három kristálygeneráció fizikai állandói a következők: első generáció: bomláspont: 250—251 C°; (a)*> = - 90,5° (c = 0,5, ecetsav); ID50 =0,05y; vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat (futtatószer = = kloroform: metanol: ecetsav = 95: 4:1); foltok aránya: Rf =0,35: R f =0,39 = 1:1-1: 2; második generáció: bomláspont: 253—254 C°; (a)2o=-91,5° (c =0,5, ecetsav); ID50 =0,05y; vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat (futtatószer = = kloroform: metanol: ecetsav = 95 : 4: 1): fő folt 5 Rf = 0,35-nél, nyomnyi mennyiségű anyag R f = = 0,42-nél; harmadik generáció: 1.0 bomláspont: 254—255 C°; (a)*° =-95,5° (c =0,5, ecetsav); ID50 =0,05y; vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat (futtatószer: kloroform: metanol: ecetsav = 95: 4: 1): fő folt 15 Rf = 0,39-nél, nyomnyi mennyiségő anyag R f = = 0,42-nél; a termék infravörös spektrumát az 1. ábra mutatja be. Elemanalízis (talált): C% 60,14 H% 9,38 N% 9,74; a termék mérsékelten oldódik dimetilszulfoxidban, 20 dimetilformamidban és ecetsavban, gyengén oldódik metanolban (5—10 mg/ml), a pepsztatin-metilészternél azonban jobb az oldhatósága. 25 4. példa 6,0% glükózt, 2,0% glicerint, 4,0% fölözött tejet, 4,5% kazeint, 0,1% K2 HP0 4 -t, 0,3% NaCl-t, 0,1% MgS04 • 7Ha O-t tartalmazó 130 liter tápközeget Strep-30 tomyces testaceus ATCC 21469 törzzsel oltunk be (a tápközeg pH-ja 6,8), majd a tápközeget az 1. példában megadott feltételek között inkubáljuk 137 órán keresztül. 125 liter fermentléhez — amelynek antipepszin-aktivitása megfelel 170 g antipepszinnek — hozzáadunk 35 60 liter n-butanolt, majd az elegyet 40 percen keresztül szobahőmérsékleten keverjük; A fenti idő elteltével a butanolos fázist, a vizes fázist és a micéliumokat tartalmazó szilárd fázist centrifugálással különválasztjuk, a butanolos fázist vízzel mossuk és vákuumban 1,5 liter 40 térfogatú sziruppá sűrítjük. A szirup pH-ját 3,0-ra állítjuk be, majd keverés közben 7,5 liter n-hexánt adunk hozzá. A kivált sárgásbarna csapadékot 60 percen keresztül keverjük, szűrjük, mossuk, majd vákuumban megszárítjuk. Ilyen módon 164 g súlyú találmány sze-45 rinti új pepsztatin-származék tartalmú terméket kapunk. Az anyag antipepszin-aktivitása 0,075 y. 150 g új pepsztatin-származékot 40—50 C°-on feloldunk 1,5 liter 90%-os metanolban, majd az oldatot 50 150 g aktívszénnel derítjük. 1,6 liter derített metanolos oldatot szobahőmérsékleten hozzáadunk 1 liter vízhez. A kivált gélszerű csapadékot szűrjük, 50%-os metanollal mossuk és liofilizáljuk. Ilyen módon 94 g enyhén sárgás színű port kapunk. A termék antipepszin-aktivitása 55 (IDS0 ) 0,062. A port 90%-os metanolban oldjuk és a fent ismertetett módon kétszer aktívszénnel kezeljük. Ilyen módon 45 g új pepsztatin-származék tartalmú fehér port kapunk. A termék ID50 -értéke 0,055y, bomláspontja 198—205 C°, forgatása (a)g> =-79° (c = l,0, 60 metanol). A vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint a termék az alábbi foltokat tartalmazza: Rf = 0,35 (pepsztatin); Rf = 0,39 (pepsztatin B és pepsztatin C); 65 Rf = 0,42. 3
