166473. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfoenolpiro szőlősav és sói előállítására

5 166473 6 szemben. Az aktivitás akkor megfelelő, ha az extinkciókülönbség a 0. percben mért, s a 60. percben mért érték között minimum 0,5. c) A reakció 1000 ml 15%-os 3-foszfoglicerinsav-báriumsó szuszpenzióból báriummentesítéssel készült oldathoz 100 ml 4.10-2 mólos magnéziumacetát oldatot adunk, a pH-t 5-6 n vizes nátriumhidroxid-oldattal 7-re állítjuk, 50 C°-ra melegítjük, majd hozzáadjuk az a) pontban nyert csapadék 200 ml desztillált vízzel készült szuszpenzióját. A reakciót 50 C°-on addig folytatjuk, amíg a 240 nm-nél mérve még extinkciónövekedést tapasztalunk (1,5-2 óra). d) A foszfoenolpiroszőlősav ezüst-báriumsóvá alakítása Az összes következő műveletet a PEP-ezüstbáriumsó fényérzékenysége miatt sötét helyiségben, vörös fény mellett végezzük. A kész reakcióelegyet jégfürdőben lehűtjük, hozzáadunk 225 ml 3 mólos salétromsavat és 280 ml 25%-os ezüstnitrátot. A csapadékot leszűrjük, a tiszta szűrlethez 200 ml 50%os báriumacetát oldatot adunk. 1 éjszakán át hideg szobában állni hagyjuk, másnap leszűrjük. A csapadékot desztillált vízben feloldjuk [20 g csapadék/250 ml desztillált víz arányban] és teljes feloldódásig 3 mólos salétromsavat adagolunk hozzá. Aktívszénnel elkeverve szűrjük, a tiszta felülúszóhoz 2 ml 50%-os báriumacetátot adunk, majd 1 : 4-es hígítású ammóniumhidroxiddal a pH-t addig emeljük, amíg a foszfoenolpiroszőlősav-ezüstbáriumsó kristályok ki nem válnak. Hozam: 22 g foszfoenolpiroszőlősav-ezüstbáriumsó. Hatóanyagtartalom foszformeghatározás alapján: 96,5%. Szervetlen foszfortartalom: kisebb, mint 0,1%. A savlabilis foszfor az organikusan kötött foszfornak 98%-a. 2. példa. 30 kg friss, világos színű kereskedelmi sörélesztőt húsdarálón keresztül 3 liter toluollal egybedarálunk, falapáttal kevergetve 40 C°-on autolizáljuk. Elfolyósodás után hozzáadunk 500 g glukózt és 90 g dinátriumhidrogénfoszfátot, majd az autolízist 40 C°-on addig folytatjuk, amíg a közben végzett aktivitásmérések szerint az enzim fel nem szabadult (kb. 3 óra). 24 liter desztillált vizet adunk hozzá, ülepítő centrifugán lecentrifugáljuk, a felülúszót diatomaföld-alapú Hyflo Super Cel (gyártó: Johns Menville cég) ágyon tükrösre szűrjük. 10 C°-ra hűtjük, majd azonos térfogatú 0 C°-os acetont adunk hozzá. A kapott csapadékot dekantáljuk, a maradék szuszpenzióhoz 660 g Hyflo Super Cel-t adunk és centrifugáljuk. A centrifugálásnál kapott csapadékot acetonnal mossuk és levegőn szárítjuk. így 720 g, hidegen hónapokig tárolható enzimkészítményhez jutunk. 4500 g 3-oszfoglicerinsav-báriumsót vízben szuszpendálunk és báriummentesítés után a tisztára szűrt 5 oldatot 36 literre töltjük fel. Hozzáadunk 3 liter 3.10~2

mólos magnéziumacetát oldatot, 50 C°-ra melegítjük, a pH-ját 7-7,1-re állítjuk és hozzáadjuk a 720 g száraz enzimkészítményt. A reakciót az 1. példában leírt módon végezzük. 10 A reakció befejeztével a lehűtött reakcióelegyhez 6,8 1 3 mólos salétromsavat és 8,4 1 25%-os ezüstnitrát oldatot adunk. Innen kezdve az összes műveletet sötét helyiségben vörös fény mellett végezzük. A csapadékot leszűrjük, a szűrlethez 6 1 50%-os 15 báriumacetát oldatot adunk. Egy napi állás után a csapadékot szűréssel kinyerjük. Az összes többi műveletet az 1. példában leírtakkal azonos módon végezzük. Hozam: 650 g foszfoenolpiroszőlősav-ezüstbá-20 riumsó. Hatóanyagtartalom foszformeghatározás alapján: 96,2%. Szervetlen foszfortartalom: kisebb, mint 0,1%. A savlabilis foszfor az organikusan kötött fosz-25 fórnak 97,5%-a. 3. példa. 30 Kristályos foszfoenolpiroszőlősav-triciklohexilammónium só előállítása. 95 g foszfoenolpiroszőlősav ezüstbáriumsót 5C0 ml desztillált vízben szuszpendálunk, 300 ml n sósavat 35 adunk hozzá az ezüstionok leválasztásához, majd kb. 300 ml 2 n kénsavat a báriumionok leválasztásához. A kénsav adagolás végpontját rodizonátos színreakcióval ellenőrizzük. A csapadékos oldatot lecentrifugáljuk, a tiszta felülúszó pH-ját ciklohexil-40 aminnal 8-ra állítjuk. Az oldatot 50 C-ra melegítjük és opálosodásig acetont adunk hozzá. Lehűtjük 0 C°ra és megvárjuk a tűs kristályok megjelenését. Ezután hideg acetont adagolunk hozzá úgy, hogy az összesen hozzáadott aceton mennyisége 4 liter le-45 gyen. Egy éjszakai állás után a kristályokat kinyerjük és P2O5 fölött szárítjuk. Hozam: 80 g foszfoenolpiroszőlősav triciklohexilammónium só. Hatóanyagtartalom foszformeghatározás alapján: 50 98%. enzimatikus mérés alapján: 96%. (Az enzimatikus mérést a Boehringer Katalog, 1973, N°. 15308 alapján végeztük.) 55 Szervetlen foszfortartalom: kisebb, mint 0,1%. Szabadalmi igénypontok: 60 1. Eljárás foszfoenolpiroszőlősav 3-foszfoglicerinsavból enzimatikus reakciókkal történő előállítására, s kívánt esetben só képzésére, azzal jellemezve, hogy 3-foszfoglicerinsavat egy élesztő autolízisével és az 65 autolizátum oldószeres frakcionált kicsapásával ka-3