166473. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfoenolpiro szőlősav és sói előállítására

3 166473 4 szerűen és gyorsan végrehajtható, és előnyösen jó hozammal szennyezésektől mentes, enzimatikus mérésekre alkalmas tisztaságú terméket eredményez. A találmány alapja az a felismerés, hogy 3-foszfoglicerinsavat élesztőből kapott enzimkészítménnyel reagáltatva jó hozammal kaphatunk foszfoenolpiroszőlősavat, ugyanis az élesztő autolizisével és oldószeres frakcionált kicsapásával kapott enzimkészítmény az átalakításhoz szükséges mindkét - foszfogliceromutáz és enoláz - enzimet aktív állapotban tartalmazza. Ez egyrészt azért meglepő, mert ismeretes, hogy a foszfogliceromutáz enzim rendkívül instabil és spontán elveszti aktivitását (Arch. Biochem. Biophys. 115, 53 [1966]), másrészt az oldószeres (alkoholos, acetonos, metanolos) frakcionált fehérjekicsapás éppen a különböző enzimek elválasztására általánosan használt (Straub, B.: Biokémia, 1958,56). A találmány alapja továbbá az a felismerés is, hogy az átalakítást katalizáló enzimek jobb hatásfokkal nyerhetők ki, ha az autolízist az élesztő által asszimilálható cukor és szervetlen foszfát jelenlétében végezzük. Ilyen hatás eddig az irodalomban nem volt ismeretes. Végül a találmány alapja az a felismerés, hogy a reakció előnyösebben hajtható végre 50-55 C° hőmérsékleten, mint szobahőmérsékleten. Ez a felismerés azért meglepő, mert az enzimek ezen a hőmérsékleten általában inaktiválódnak. Az enzimreakciókat szokásosan 20-24 C°-on hajtják végre. A találmány tárgya eljárás foszfoenolpiroszőlősav és sói előállítására 3-foszfoglicerinsavból enzimatikus reakciókkal. A találmány lényege az, hogy 3-foszfoglicerinsavat élesztő autolizisével és az autolizátum oldószeres frakcionált kicsapásával kapott enzimkészítménnyel reagáltatunk 6 és 8 közötti pH tartományban, 20-60 C°, előnyösen 50-55 C° közötti hőmérsékleten, majd a reakcióelegyből a fehérjék kicsapása után a foszfoenolpiroszőlősavat kinyerjük és adott esetben kristályos sójává alakítjuk. A kiindulóvegyületként használt 3-foszfoglicerinsav az irodalom alapján előállítható (Colowiczk, Kaplan: Methods in Enzymology, 1957, Vol. Ill, 208-214). Az élesztő autolízisét célszerűen cukor és szervetlet foszfát jelenlétében hajtjuk végre. Cukorként előnyösen glukózt, fruktózt vagy szacharózt alkalmazunk. A reakcióelegyből a foszfoenolpiroszőlősavat előnyösen az ismert ezüst-báriumsója vagy ciklohexilaminsója alakjában kristályosítjuk ki, de maga a foszfoenolpiroszőlősav, vagy más sója, például nátriumsója alakjában is elkülöníthető. Foszfoenolpiroszőlősav előállítására a találmány értelmében célszerűen a következőképpen járunk el: A sör- vagy sütőélesztő masszát kevés toluollal eldolgozzuk, elfolyósodás után cukrot és szervetlen foszfátsót adunk hozzá, majd 38 C°-ra melegítve ezen a hőmérsékleten autolizáljuk. Az autolízis menetét óránként ellenőrizzük. Amikor az autolizátum aktivitása a később részletezett, Boehringer Katalog szerint mért kívánt értéket (96%) elérte, az autolizátumot vízzel kétszeresére hígítjuk és centrifugáljuk. A tiszta felülúszóból az enzimeket egy vagy több lépésben valamely alkohollal vagy acetonnal kicsapjuk, és Rentrjfugálássgl vagy szűréssel elkülönítjük. A kinyert fehérjecsapadékot azonnal 3-foszfoglicerinsav semlegesített oldatába (pH = 6-8) visszük, és célszerűen 50 C°-ra melegítjük. A reakció előrehaladását a későbbiekben részletezett mó-5 don fotometriásan ellenőrizzük. A reakcióegyensúly leállta után az elegyet lehűtjük és a fehérjék ismert módon történt kicsapása után a foszfoenolpiroszőlősavat, célszerűen - ismert módon - ezüst-báriumsó formájában kinyerjük. A nyers terméket savanyúan 10 oldva átkristályosítjuk. Ciklohexilamin só előállítása céljából az ezüst-báriumsót vízben szuszpendáljuk, 3 n salétromsavval pH = 1 értékig savanyítjuk, majd ismert módon ezüst- és báriummentesítjük, a savanyú oldatot ciklohexilaminnal semlegesítjük és 15 a foszfoenolpiroszőlősav ciklohexilamin sóját szerves oldószerrel kicsapjuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei az ismert eljárásokkal szemben: a reakció ipari méretekben is könnyen kivitelezhető; a reakció rövid idő 20 alatt, vizes oldatban, egyszerű körülmények között megy végbe; a reakció során mellékreakciók nem mennek végbe; a reakció kis térfogatban, koncentráltan hajtható végre, és szennyezésektől mentes, enzimatikusan 96% feletti tisztaságú végterméket 25 eredményez. A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákon mutatjuk be: 1. példa. 30 a) Az enzimpreparátum készítése 1 kg friss kereskedelmi sütőélesztőt 100 ml toluollal elfolyósodásig gyúrunk úgy, hogy az élesztő 35 hőmérséklete 40-42 C° legyen. Az elfolyósodás után 20 g glukózt és 3 g dinátriumhidrogénfoszfátot adunk hozzá, majd 38 C°-os hőmérsékleten tartva az aktivitást óránként ellenőrizzük. Ha az aktivitásérték a b) pontban leírtak szerint megfelelőnek mu-40 tatkozik (3-6 óra), az autolizátumot desztillált víz' zel kétszeresére hígítjuk és centrifugáljuk. A centrifugálással kapott felülúszót lehűtjük és a felülúszó oldat fele térfogatának megfelelő mennyiségű 0—5 C°-ra hűtött acetont adunk hozzá. A képződött 45 csapadékot centrifugálással eltávolítva a hideg felülúszóhoz az előzővel azonos mennyiségű 0-5 C° hőmérsékletű acetont adunk, majd a képződött csapadékot centrifugálással összegyűjtve azonnal felhasználjuk PEP előállítására. b) Aktivitásmérés Az autolizátumból óránként 25 ml mintát veszünk 55 és az a) pontnak megfelelő módon acetonos frakcionálásnak vetjük alá. A kapott enzimcsapadékot 6 ml desztillált vízben szuszpendáljuk. A szuszpenzió 1 ml-éhez hozzáadunk 5 ml 15%-os 3-foszfoglicerinsav-báriumsó szuszpenzióból báriummentesítéssel 60 készült oldatot és 0,5 ml 4.10-3 mólos magnéziumacetát oldatot, és a pH-érték nátriumhidroxiddal 7,5-re állítása után 50 C-on tartva keverjük. A reakcióelegyből 10 percenként 0,05 ml-t 10 ml desztillált vízbe pipettázunk, és megmérjük az ol-65 dat fényelnyelését 240 nm-nél desztillált vízzel 2