166412. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új antibiotikum előállítására
5 166412 6 lonnaolajat, szójababolajat stb.) adhatunk a rendszerhez. A Streptomyces Sp. X—5108 törzs fermentációját a folyékony táptalajok széles skáláján elvégezhetjük. A találmányunk szerinti új antibiotikum előállítására különösen alkalmas táptalaj asszimilálható szénforrást (pl. keményítőt, glükózt és melaszt stb.), asszimilálható nitrogénforrást (pl. fehérjét, fehérjehidrolizátumot, polipeptideket, aminosavakat, kukoricalekvárt, ammóniumsókat) és szervetlen kationokat és anionokat (pl. nátriumot, káliumot, kalciumot, magnéziumot, szulfátot, foszfátot, kloridot stb.) tartalmazhat. A táptalaj egyéb komponenseinek szennyezéseként nyomelemek (pl. kobalt, réz, vas, molibdén, bór stb.) lehetnek jelen. A X—5108 antibiotikum aktivitását a Gram-pozitív Bacillus E baktérium gátlási zónájának meghatározásával a szokásos „cup plate" agar diffúziós módszerrel állapíthatjuk meg. E célra Bacillus simplex baktériumot is alkalmazhatunk. Mindkét baktérium önkényesen meghatározott 1 egység/ml-es oldattal kb. 20 mm-es gátlási zónát ad. A teszt módszer során a teszt-organizmus tenyészetét megfelelő táptalajon (pl. triptikázzal hidrolizált szójatápoldat) forgó rázógépen (100 ml táptalaj 500 ml-es Erlenmeyer lombikban) 18 C°-on24 — 42 órán át tenyésztjük. A 0,25—0,5%-os inokulumkoncentrációval beoltjuk a 4 ml-es csírarétegszuszpenziót, melyet 100 ml-es üveg vagy műanyag Petri-csészében levő 20 ml, előre keményített agar-alaptáptalaj réteg fölé öntünk. A lemezeket lyukasztás előtt legalább 2 órán át hűtjük, majd betöltjük az antibiotikumot tartalmazó teszt-oldatot. A lemezeket 35 C°-on 18 órán át inkubáljuk és a legközelebbi 0,5 mm-es részben levő zónák átmérőit megmérjük. A hatékonyságot (egység/ml) standard görbék segítségével számítjuk. Az előnyösen felhasználható táptalaj-típusokat, valamint a rázatott lombikban és levegőztetett fermentorban végrehajtott fermentációnál kapott antibiotikum-hozamokat a 6—9. táblázatban foglaljuk össze. A fent említett adatokból kitűnik, hogy az antibiotikum termelést különböző forrásokból származó komplex nitrogéntartalmú anyagok kedvezően befolyásolják. így pl. növényi eredetű anyagok (pl. szójababliszt, gyapotmagliszt, zabliszt, paradicsompüré), állati eredetű anyagok (pl. halliszt, húsliszt, aminosavhidrolizátum) és mikrobás eredetű sejtek (torulaélesztő) alkalmazhatók. Számos szénforrás jó növekedést és antibiotikum termelést biztosít (pl. glükóz, glicerin, dextrin és kukoricakeményítő). Bizonyos esetekben a növekedés és antibiotikumhozam — az alaptáptalajban levő komponensektől függően — kedvezően befolyásolható oly módon, hogy a természetes táptalajban levő szervetlen sókon kívül további sókat (pl. káliumfoszfátot, kalciumkarbonátot, magnéziumszulfátot) és nyomelemeket adunk a rendszerhez. Nagy fermentorokban történő X—5108 antibiotikum-gyártáshoz előnyösen alkalmazhatunk pl. 1% zsírtalanított gyapotmaglisztet, 0,5% kukoricalekvár-koncentrátumot, 1% kukoricakeményítőt, 0,1% dikáliumhidrogénfoszfátot és 0,1% kalciumkarbonátot tartalmazó táptalajt. A Streptomyces Sp. X—5108 törzs jó növekedést és antibiotikum-termelést mutat bizonyos kémiailag meghatározott, szintetikus táptalajokon, melyek nitrogénforrásként ammóniumsókat, nitrátot, vagy aminosavakat (glutamátot, arginint, glicint); szénforrásként glükózt, dextrint, keményítőt, citrátot, acetátot stb., továbbá sókat (pl. káliumfoszfátot, kálciumkarbonátot és magnéziumszulfátot), valamint nyomelemeket (Fe++ , Cu++ , Mn ++ , Co ++ , Zn ++ ) tartalmaznak. A Streptomyces Sp. X—5108 törzsnek különböző szintetikus táp-5 talajon végrehajtott fermentációjánál kapott eredményeket a 10. táblázatban ismertetjük. A 10. táblázat eredményeiből kitűnik, hogy szintetikus táptalajok alkalmazása esetén gyengébb antibiotikum- termelést kapunk, mint komplex nitrogéntartalmú táptalajon. 10 A X—5108 antibiotikum termelését az erős levegőztetéssel fokozhatjuk. A fermentációt a mikroorganizmus megfelelő növekedését biztosító bármely hőmérsékleten elvégezhetjük. így pl. a Streptomyces Sp. X—5108 törzset rázott lombikban 24, 28, 30 és 32 C°-on inkubál-15 hatjuk. 3, 4, 5 és 6 nap után végrehajtott antibiotikummeghatározás azt mutatja, hogy 24—32C°-os hőmérsékleten azonos maximális antibiotikum hozam érhető el. Azt találtuk azonban, hogy maximális kitermelés 30— 32 C°-on 3—4 nap alatt, 28 C°-on 4 nap alatt és 24 C°-on 20 5—6 nap alatt érhető el. Az X—5108 antibiotikum optimális termelése általában 2—10 nap alatt biztosítható. A fermentlé pH-ja a fermentáció alatt közel semleges vagy enyhén savas. A végső pH részben a jelenlevő puffertől, részben a táptalaj kezdeti pH-jától függ. (Ez 25 utóbbi sterilezés előtt előnyösen közel semleges). A fermentáció befejezése után a X—5108 antibiotikumot a fermentléből többféleképpen izolálhatjuk és tisztíthatjuk. Az antibiotikum izolálását és tisztítását előnyösen oldószeres extrakcióval (pl. szakaszosan vagy 30 ellenáramú folyamatos folyadék-folyadék extrakciós oszlopokon), továbbá gél-kromatográfiával nem vizes közegben végezhetjük el. A X—5108 antibiotikum izolálását előnyösen oly módon végezhetjük el, hogy a micéliumot és az oldhatatlan 35 szilárd anyagokat a fermentlétől valamely szokásos módszerrel (pl. szűréssel vagy centrifugálással) elkülönízjük. A X—5108 antibiotikumot a szűrt vagy centrifugált fermentléből szakaszos vagy ellenáramú extrakciós módszerekkel extraháljuk. Az oldószeres extrakciót 40 kh. 3—7,5 pH-intervallumban végezhetjük el. Oldószerként vízzel nem elegyedő észtereket (pl. etilacetátot, amilacetátot, butilacetátot, más alifás észtereket; előnyösen butilacetátot) alkalmazhatunk. Ellenáramú tisztításos módszernél oldószer-rendszerként előnyösen 45 etilacetát, izoptopanol és 0,1 mólos vizes szekunder nátriumfoszfát oldat-elegyét alkalmazhatunk. A X—5108 antibiotikum végső tisztítását gél-kromatográfiával végezhetjük el. Az előzetesen tisztított antibiotikumot (pl. oldószeres extrakcióval kapott termékek) 50 térhálós vagy polimerizált dextrán gélen adszorbeáljuk. Előnyösen járhatunk el oly módon, hogy az előzetesen tisztított antibiotikumot Sephadex-LH-20-on kromatografáljuk és alkohollal eluáljuk. A fermentlé szűrése vagy centrifugálása után az X— 55 5108 antibiotikum elemzésére vékonyréteg- vagy papírkromatográfiás módszereket alkalmazhatunk. Az antibiotikum szín-jellemzői miatt a foltok kiértékelését fluoreszcens indikációs módszerrel végezhetjük el; ezenkívül bioautográfiát is előnyösen alkalmazhatunk. A 60 kromatográfiás módszert papíron vagy előnyösen szilikagél üveglemezeken végezhetjük el. A vékonyrétegkromatográfiás módszernél kloroform, metanol és vizes ammóniumhidroxid elegyét alkalmazhatjuk. Az új X—5108 antibiotikum tisztítás után amorf 65 sárga anyag, A X—5108 antibiotikum gyógyászati 3
