166364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz kinyerésére

166364 választanánk azokat egymástól, oly módon, hogy a „Batch"-eljárásban annyi ioncserélőt alkalmazunk, amíg mind a két enzim adszorbeálódik. Aztán az ioncserélőt elválasztjuk és a fent leírt módon mossuk, majd végül eluálunk. Mindkét enzim tisztítására és dúsítására szolgáló további lehetőség szerint kisózást, illetve só-frakcionálást hajtunk végre, például ammóniumszulfát alkalmazásával. Ammóniumszulfát alkalmazása esetén a kreatinin-amidohidroláz 2,2 mól, a kreatin-amidinohidroláz, azaz a két enzim keveréke 2,7 mól sókoncentráció értéknél válik ki. A kisózás alkalmas az enzimeknek oldataikból való kinyerésére, amelyeket például az ioncserélőn történő eluciónál nyerünk. 4 C°-on végzett dialízissel, célszerűen valamilyen hígított pufFerrel, például 0,02 mólos dietanolamin-pufferrel szemben, amelynek a pH-ja 8,0, az enzimek könnyen megszabadíthatok a sóktól és más kis molekulájú kísérő anyagoktól. Az ily módon kapott preparátumot befagyasztott állapotban hónapokig tárolhatjuk anélkül, hogy az az aktivitásából veszítene. Abban az esetben, ha a kreatinin-amidohidrolázt egyedül kívánjuk kinyerni, kívánatos egy további tisztítási és dúsítási módszer, amely egy 60 C°-on történő melegítési lépésből áll. Egy ilyen típusú 5 perc időtartamú melegítés nem eredményez észrevehető csökkenést a kreatinin-amidohidroláz aktivitását illetően. Ezzel ellen-10 15 20 25 (0,01 mól végmolaritás) és ammóniumklorid (0,1 mól végmolaritás) hozzáadása után az extraktum 1 literére számítva 10 percen belül 0,8 térfogat 90%-os vizes izopropanolt adunk és az elegyet 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük. A kivált dús csapadékot centrifugáljuk. Az elkülönített felülúszóhoz literenként 0,45 térfogat 90%-os izopropanolt adunk. Az ily módon képződött csapadékot, amely a kreatinin-amidohidrolázt és a kreatin-amidinohidrolázt tartalmazza, elválasztjuk, és 400 ml 0,02 mólos káliumfoszfát-pufferben, amelynek pH-ja 8,0 felvesszük. Az oldhatatlan maradékot elválasztjuk és az elkülönített oldatot egy azonos puíferral kiegyenlített DEAE-Sephadex-oszlopra (3,5 cm X 1 m) visszük fel. A felvitel után az oszlopot 1 térfogat 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferral, amelynek a pH-ja 8,0, mossuk és aztán 0,2 mólos káliumfoszfát-pufferral, amelynek pH-ja 8,0, eluálunk. A kreatinin-amidohidroláz tartalmú frakciókat tisztítjuk, 8-as pH-n 2,2 mól mennyiségig ammóniumszulfátot adunk hozzá, a kivált enzimet centrifugáljuk és 100 ml 0,02 mólos 8-as pH-jú dietanolamin-pufferban oldjuk, majd +4 C°-on 4 órán át ugyanazon puíferral szemben dializáljuk. Ily módon 64% összkitermelésben egy olyan preparátumot kapunk, amelynek specifikus aktivitása 303 E/mg. Az alább közölt táblázat összefoglalóan tartalmazza az eljárás egyes lépéseiben kapott aktivitási és kitermelési értékeket. Lépések E (25 C°) Fehérje g-ban E/mg Kitermelés % Diszperziós eljárás 2,8 x 105 98,6 2,8 100 Polietilénimin-kezelés után elkülönített rész 2,6 x106 66,2 3,9 93 Első izopropanol hozzáadás után elkülönített rész 2,16 xlO5 32,6 6,6 77 Második izopropanol hozzáadás után elkülönített csapadék 1,97 x 105 6,9 28,5 71 DEAE-Sephadex kromatográfiás oszlop eluátuma 1,8 x 105 0,59 303 64 tétben a fenti feltételek mellett a kreatin-amidinohidroláz elveszti az aktivitását. A találmány szerinti eljárással előállított új enzimek mind tudományos célokra, mind a kreatinin és a kreatin specifikus meghatározására felhasználhatók. Az itt következő példák a találmány további megvilágítására szolgálnak. 1. példa a) Nagy tisztaságú kreatinin-amidohidroláz izolálása. Kreatinin jelenlétében tenyésztett Alcaligenes spec. WS 51 400 (a deponálás helye a Technische Universität, München, Weihenstephan törzsgyűjteménye) kultúrából (lásd a 163 492 sz. magyar szabadalmi leírást) a sejteket (1 kg száraz súly) elkülönítjük, 0,1 mólos káliumfoszfát-pufferrel, melynek a pH-ja 8,0, felvesszük és 20 literre hígítjuk, majd hűtés nélkül nagynyomású diszpergálással kb. 800 atü nyomáson feltárjuk. Az extraktot egy 10%-os polietiléniminoldat (Polyimin P., BASF) (molekulasúlya kb. 1800), melynek pH-ja 8,0, 5 tf%-nyi mennyiségével (kg 1 liter) keverjük el. Káliumklorid 45 50 55 60 Ha a nagynyomású diszperzió helyett ultrahangos feltárást végzünk, a kapott kreatinin-amidohidroláz menynyisége kb. ugyanolyan specifikus aktivitás mellett 2,5-szörösére növelhető az alkalmazott mikroorganizmus súlyára vonatkozóan. A fent leírt módon kapott kreatinin-amidohidroláz egyensúlyi állandója: [kreatin] K== 1,27 [kreatinin] (37C°-on;pH:8-on). A kreatinra, mint chaelis állandó: KM

=3,3X10-2

M szubsztrátumra vonatkozó Mi(37C°-on;pH:8-on). 2. példa Kreatinin-amidohidroláz és kreatin-amidinohidroláz elválasztása. Az 1. példában leírt módon járunk el, de a kreatininamidohidroláznak az ioncserélő-oszlopról történő eluá-65 lása után a kreatin-amidinohidrolázt 0,2 mólos 8-as 3