166364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz kinyerésére
166364 pH-jú káliumfoszfát-pufferral, amely 0,3 mól nátriumkloridot tartalmaz, eluáljuk. A részletekről a következő táblázat ad felvilágosítást: cen át szobahőmérsékleten keverjük, maj'd centrifugáljuk. A fölötte levő folyadékhoz további 0,45 térfogat izopropanolt adunk és újból centrifugáljuk. Lépések Fehérje mg-ban Kreatinin-amidohidroláz Kreatin-amidino-Lépések Fehérje mg-ban E E/mg E E/mg Az izopropanalos kezelés után DEAE-Sephadex mosóvíz 0,20 mól pH : 8 (eluátum) 0,50 mól pH : 8 (eluátum) 175 90 29 13,7 860 1 787 1,8 4,9 27 0,13 44 0 0 41 0,25 3,0 A kreatinin-amidohidroláz és a kreatin-amidinohidroláz DEAE-Sephadex-anioncserélő oszlopon történő elválasztása. 3. példa Az 1. példában leírtak szerint járunk el, de a DEAESephadex-kroma to gráfia helyett ún. „DEAE- Batch"-eljárást alkalmazunk, a következők szerint. 100 g Alcaligenes spec. WS 51 400-ból kiindulva a második izopropanolos csapadékot 100 ml 0,02 mólos 8,0 pH-jú káliumfoszfát-pufferban oldjuk és annyi DEAESephadex-et adunk hozzá, míg a folyadékban már csak 5% enzim marad vissza (kb. 20 g nedves ledöngölt ioncserélő). Az ioncserélőt szűrjük, kb. 100 ml 0,08 mólos 8-as pH-jú káliumfoszfát-pufferrel mossuk és a két enzim egyesített eluátumát 100 ml 0,2 mólos 8-as pH-jú káliumfoszfát-pufferral, mely 0,3 mól káliumkloridot tartalmaz, 15 percen át +4 C°-on keverjük és végül szűrjük. Mindkét enzim az eluátumban található. Ammóniumszulfáttal történő kicsapas után a kapott preparátum 31,5 E/mg aktivitású kreatinin-amidohidrolázt és 1,1 E/mg aktivitású kreatin-amidinohidrolázt tartalmaz, mint ahogyan az az alább közölt táblázatból kiderül. 15 A csapadékot az 1. példában leírt módon felvesszük és DEAE-Sephadex-oszlopon kromatografáljuk, miközben csupán a kreatinin-amidohidrolázt eluáljuk. Az itt következő táblázat megvilágítja az eljárás részleteit. Az így kapott preparátum alkalmas kreatinin-meghatáro-20 zásra. Az előbbi példákban leírt eljárások során a kreatininból kreatinin-amidohidroláz jelenlétében képződött kreatint oly módon határoztuk meg, hogy az elegyhez adenozintrifoszfátot (ATP) adtunk, amelynek hatására 25 kreatinfoszfokináz (CPK) jelenlétében kreatinfoszfát és adenozinfoszfát (ADP) képződött. A képződött ADP-t piruvátkinázzal (PK) és laktátdehidrogenázzal (LDH), továbbá foszfoenolpiruváttal (PEP) NADH-felhasználás mellett ATP-vé alakítjuk és a NADH-fogyasztást 30 optikailag mérjük. Ezek az ismert lépések a következők: 1. kreatin + ADP^kreatinfoszfát + ADP 2. ADP + PEPP ^ piruvát + ATP 35 3. piruvát +NADH +H +L ° H laktat +NAD+ A kreatin-amidinohidroláz-meghatározást úgy végezzük, hogy a kreatinból képződött karbamidot mérjük az ureáz-eljárás szerinti hasítással. Lépések Fehérje Kreatinin-amidohidroláz Kreatin-amidiohidroláz Lépések g-ban E E/mg E E/mg Feltárás 26,1 2,4 x 105 0,92 6 xlO2 0,023 2. izopropanol hozzáadás (csapadék) 1,43 l,98xl04 13,9 3,8 x 102 0,265 DEAE-Sephadex eluátum, 0,5 mól pH: 8 0,370 l,16xl04 31,5 4,1 xlO2 1,1 100 g (szárazsúlyú) Alcaligenes spec. WS 51 400-ból készített kreatinin-amidohidroláz és kreatin-amidinohidroláz enzimkeverék frakcionálása 50 4. példa 7 g (szárazsúly), kreatinin jelenlétében tenyésztett Alcaligenes spec. WS 51 400-t pH: 8-on ultrahang segítségével feltárunk. A kapott szuszpenziót az 1. példában leírt módon 0,8 térfogat izopropanollal kezeljük, 30 per-55 A kreatinra vonatkozó Michaelis-állandó t 25 C°-on; pH: 7,6 értéknél határoztuk meg: KM = 5X10-2 M. 1 egység kreatinin-amidohidroláz az az enzimmenynyiség, amely 1 perc alatt 1 pimól szubsztrátot hasít. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz kinyerésére, kreatinin-amido-Lépések E (25 C°) Fehérje g-ban E/mg Kitermelés Ultrahang feltárás 2. izopropanol hozzáadás (csapadék) DEAE-Sephadex eluátum 1,5 x 103 1,2 x 103 0,7 x 103 1,780 0,119 0,028 0,85 10,1 25 100 80 47 4
