166364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz kinyerésére
3 166364 4 a) Kreatinin +H20 kreatin-aminohidroi áz kreatin b) Kreatin + H20 kreat in-amidin ohidrol áz szarkozin + karbamid Mivel az a) folyamat szerinti egyenlet olyan egyensúlyi reakció, amelyben vízfelvételről, ill. vízleadásról van szó, a folyamatot katalizáló enzimet kreatinin-amidohidroláznak nevezzük. Mindkét enzim kinyerésére kiindulási anyagként olyan mikroorganizmusok felelnek meg általánosan, amelyekben a kívánt enzimek adaptative feldúsultak, amely a szokásos módon úgy érhető el, hogy a tenyésztést kreatinin jelenlétében vagy hozzáadásával végezzük. Az ily módon nyert mikroorganizmusból feltárás útján kinyerünk egy vízoldható frakciót. Feltárási módszerként a szokásos módszerek felelnek meg az alkalmazott mikroorganizmus sejtfalának (sejthártyájának) szilárdságától és ellenállóképességétől függően. Különösen alkalmasnak mutatkozik mind a nagynyomású diszperzió-, mind az ultrahang-feltárás. Alkalmas feltárási módszerként említhetők például a dezintegrációs malmok, pl. a Balutini- és Schlossmann-féle és a hasonló alapon működő egyéb feltárási módszerek. Kémiai és enzimatikus feltárási módszerek is alkalmazhatók. Az ily módon kapott vízoldható frakcióból a kreatinin-amidohidroláz feldúsítható, kihasználva azon tulajdonságát, hogy a kreatinint kreatinná alakítja. A képződött kreatin ismert módszerekkel meghatározható, pl. ATP hozzáadásával és a képződött ADP szokásos módon történő mérésével. Kívánatos, hogy 7-es pH-érték fölötti tartományban dolgozzunk és az alkalmazott tisztítási módszert a fenti pH-tartományban történő alkalmazhatósága alapján válasszuk ki. Egy további módszer a dúsítási eljárás előrehaladásának követésére abban áll, hogy a képződött kreatint kreatin-amidinohidrolázzal bontjuk, ily módon szarkozin és karbamid képződik és aztán a karbamidot szokásos módon például az ismert reakció, ureáz alkalmazásának segítségével határozzuk meg. A végrehajtott tisztítás mértéke az enzim, illetve enzimek szándékolt alkalmazási céljától függ. Abban az esetben, ha egy enzimatikus kreatinin-meghatározásra alkalmas preparátum kívánatos, elegendő már egyetlen tisztítási lépés. Alkalmas tisztítási lépés például a polianion-kezelés, a szerves oldószerekkel történő frakcionálás vagy a kromatográfia. A fent említett meghatározási módszerek alkalmazása esetén egyszerű módon lehetséges a kívánt enzim jelenlétét megállapítani és azt egyetlen lépésben jelentékeny mennyiségben feldúsítani. Mivel a feldúsított és befagyasztott mikroorganizmusok huzamosabb ideig történő tárolása azzal a veszéllyel jár, hogy a kívánt enzim aktivitása csökken, kívánatos a sejteket a dúsítás után lehetőleg gyorsan további feldolgozásnak alávetni. A találmány szerinti eljárásnál előnyben részesített két mikroorganizmust a 163 492 sz. magyar szabadalmi leírás ismerteti. A két mikroorganizmus a következő: Alcaligenes spec. WS 51 400 az Achromobactericeae családból és a Penicillum WS 90 001 (Weihenstephan). Mivel a kreatinin-amidohidroláz és a kreatin-amidinohidroláz is 6-os és annál alacsonyabb pH-értéknél gyorsan elveszti az aktivitását és pH: 8-nál rendelkezik a legnagyobb stabilitással, célszerű a feltárást alkalikus pufferrel végrehajtani. Előnyösen alkalmazható 0,1 mólos káliumfoszfát-puffer, melynek pH-ja 8,0. A pufferek és a pufferkoncentráció megválasztásánál célszerű az előrelátható további dúsítási lépést is figyelembe venni oly módon, hogy a feltárásnál alkalmazott pufferben a további dúsítás is keresztülvihető legyen. A 700—800 atü 5 nyomáson szokásos nagynyomású diszperziónál a további tisztítás polianion-kezelés alkalmazása esetén a sejtmaradék előzetes elválasztása nélkül végrehajtható. Alkalmas polianion pl. a protaminszulfát vagy vízoldható polietilénimin. A vízoldható polietilénimin hozzá-10 adás 10%-os oldat alakjában előnyös, amelynek pH-ja 8. A fenti koncentrációjú oldatból a feltárási térfogatra vonatkozóan 5% fölösleg kívánatos, amíg további csapadék már nem válik ki. A csapadék fizikai módszerekkel, például szűréssel vagy centrifugálással elkülöníthe-15 tő. A kívánt enzim az elkülönített részben marad. A polianion-kicsapás helyett előnyösnek bizonyult a szerves oldószerrel történő kicsapás. Előnyös oldószerként alkalmazható az izopropanol. Ilyen esetben a sejtmaradékot a feltárás után először eltávolítjuk és aztán 20 hozzáadjuk szobahőmérsékleten a szerves oldószert. Az izopropanolos frakcionálási előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy 25 C°-on 1 liter feltárási oldatra számítva 800 ml 90%-os izopropanolt alkalmazunk és a csapadékot elválasztjuk. A kapott csapadékhoz ismét literenként 25 500 ml izopropanolt adunk és a csapadékot, amely mindkét kívánt enzimet tartalmazza, elválasztjuk. Különösen előnyös a fent említett két módszer kombinált alkalmazása, azaz polianion-kezelés és végül szerves oldószerrel történő frakcionálás. 30 Mind az egyetlen dúsítási lépéssel, mind a kombinált lépésekkel kapott termék már alkalmas egy specifikus kreatinin-meghatározásra való felhasználásra. Mindazonáltal a kreatinin-amidohidroláz és a kreatin-amidinohidroláz itt mindig együttesen keletkezik. Abban az 35 esetben, ha kívánatos az enzimek elválasztása, akkor a fenti módon kapott preparátumot végül ioncserélőkromatográfia segítségével szétválasztjuk. Különösen alkalmas ioncserélőnek bizonyult valamely gyengén bázikus ioncserélő, mint pl. a DEAE-Sephadex vagy DEAE-40 Cellulose. A DEAE-Sephadex alkalmazása esetén az enzimeket kis ionkoncentrációban, előnyösen 0,01—0,05 mól ionkoncentráció mellett adszorbeáltatjuk az ioncserélőn. Végül az ioncserélőt kb. 0,1 mól ionkoncentrációval 45 mossuk, ami mellett a nem aktív kísérő fehérjéket eltávolítjuk. A kreatinin-aminohidroláz 0,2 mólos pufferoldattal eluálható. A kreatin-amidinohidroláz viszont a fenti elució után az ioncserélőn marad. Utóbbi oly módon eluálható, hogy ha az ionkoncentrációt 0,5 mól-50 ra emeljük, melyet pl. 0,2 mól káliumfoszfát-pufferrel, melynek pH-ja 8,0 és amely 0,3 mól nátriumkloridot vagy káliumkloridot vagy hasonló sót tartalmaz, valósíthatunk meg. A találmány szerinti eljárás fent leírt előnyös fogana-55 tosítási módja, amely egy izopropanolos-frakcionálás és egy ioncserélő-kromatográfia kombinációjából áll, az enzimek kb. 100—150-szeres feldúsulását eredményezi és olyan kreatinin-amidohidroláz-preparátumot ad, amelynek specifikus aktivitása nagyobb, mint 200 E/mg. 60 A kreatin-amidinohidroláz emellett kb. 100-szorosára dúsul fel és a preparátum 3 E/mg aktivitással rendelkezik. A találmány szerinti eljárás egy másik foganatosítási módja szerint a kívánt enzimet egy nagyon egyszerű 65 finom tisztítási módszernek vetjük alá anélkül, hogy el-2
