166363. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a Bu 1975-antibiotikum-keverék és összetevői előállítására
9 166363 10 A C2 jelű vegyület kémiailag N 1-(4-amino-2-hidroxi-butiril)-4-0-(2,6-diamino-2,4,6-tridezoxi-D-glükopiranozil)-5-0-D-ribofuranozil-2-dezoxisztreptamin. A Bu 1975 jelű antibiotikum-keverék előállítására a találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint a következőképpen járunk el: A Bu 1975 antibiotikum-keveréket termelő mikroorganizmus jól kinőtt ferde agar tenyészetével a következő összetételű inokulum-táptalajt oltunk: 1,5% glükóz 0,5% polipepton 0,2% élesztőkivonat 0,05% KH2 P0 4 0,05% MgS04 .7H 2 0 A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,5-re állítjuk be. Az inokulumot 37 C° hőmérsékleten 24 órán át rázógépen (250 fordulat/perc) inkubáljuk. A kinőtt tenyészet 2 milliliterével 100 milliliter, 500 milliliteres Erlenmeyer lombikban sterilezett, következő összetételű fermentációs táptalajt oltunk: 3% szójaliszt 2% kukoricakeményítő 1% CaCOs 0,33% MgS04 .7H 2 0. A tenyészet antibiotikum-tartalma, a rázatást 28 C° hőmérsékleten folytatva, a 3—6. napon éri el a maximumot. A fermentációs tenyészlé hatóanyag-tartalmát papírkorong-agar diffúziós vizsgálattal határozzuk meg a szokásos módon, Bacillus subtilis PCIV/219 törzset és Klebsiella pneumoniae A20680 törzset használva tesztorganizmusként. A Bu 1975 antibiotikum-keverék mindegyik összetevője (Ax, A 2 , B, C ls C 2 ) gátolja a Bacillus subtilis PCIV/219 mikroorganizmus növekedését, de csupán kettő, a Cx és C 2 jelű vegyület gátolja a Klebsiella pneumoniae A20680 törzset. Az I és II képletű vegyületeket (C vegyületek) az egyes törzsek különböző mennyiségben termelik. A rázott tenyészetekben végzett fermentációkban a C532-B2 törzs milliliterenként 50—100 mikrogramm I és II képletű vegyületet termel. Ez a Bacillus subtilis-szel szemben mért teljes antibiotikum-aktivitás mintegy 30—50%-a. A C532-B2 törzshöz képest a többi törzsek kisebb menynyiségben termelik a C jelű vegyületeket. Az összegyűjtött tenyészlevet szűrési segédanyag jelenlétében szűrjük. A szűrletben (pH 8,0) maradó hatóanyagot Amberlite IRC—50 (NH2 + -ciklusú) gyantán adszorbeáljuk. Ezután vízzel mossuk az oszlopot, majd In vizes ammóniumhidroxid-oldattal eluáljuk a hatóanyagot. A biológiailag aktív eluátumokat összegyűjt-5 jük, csökkentett nyomáson desztilláljuk és a B jelű vegyület eltávolítására n-butanollal extraháljuk a desztillációs maradékot. A vizes fázist elkülönítjük és egy NH2 + -ciklusú Amberlite CG—50 gyantából készített kromatografáló oszlopra öntjük. Vízzel, majd 0,25n 10 vizes ammóniumhidroxid oldattal mossuk az oszlopot, és az antibiotikumot 0,5n ammóniumhidroxid oldattal eluáljuk. Az eluátumokat szakaszosan gyűjtjük össze. A biológiailag aktív vegyületeket az A2 , A l5 C a és C x sorrendben eluálódnak, de az egyes vegyületek jelen-15 tősen keverednek. Az egyes vegyületek teljes elválasztása a CG—50 oszlopon való kromatográfia megismétlésével érhető el. Amint a 4. táblázat adataiból kiderül, az Ax és A 2 jelű vegyületeknek a Cx és C 2 jelű vegyületektől való 20 elkülönítésére két vékonyrétegkromatográfiás módszert — az S 110-et és S 117-et — találtuk alkalmasnak. Az S 115 módszert használva 16 óra alatt elválaszthatjuk az Ar et és a Cr et a C2 -től. Az Aly illetve A 2 jelű vegyületet a fizikai-kémiai tu-25 lajdonságok (vékonyrétegkromatográfia, infravörös abszorpciós spektrum, mágneses magrezonancia spektrum) és a baktériumellenes spektrum alapján az ambutirozin A-val, illetve az ambutirozin B-vel azonosítottuk. Az ambutirozin A-t és ambutirozin B-t tartalmazó 30 antibiotikum-keveréket a korábbi kutatások során különítettük el és vonatkozási anyagként használtuk a jelen vizsgálatokban. A következőkben elsősorban a Bu 1975 antibiotikumkeverék Cx és C 2 jelű vegyületeivel foglalkozunk (I és 35 II képletű vegyület). A Cx és C 2 jelű vegyületek fehér színű, amorf, szilárd halmazállapotú bázisok, amelyek vízben könnyen old hatók, míg gyengén oldhatók metanolban és etanolban és gyakorlatilag oldhatatlanok n-butanolban, aceton-40 ban és más szerves oldószerekben. Mindkét vegyület pozitív reakciót ad ninhidrinnel és antron-reagenssel, de negatívok a Tollens-, Fehling- és Sakaguchi-reakciók. Előállítottuk a Cx jelű vegyület dikarbonátsóját. Ez kb. 155 C° hőmérsékleten bomlás közben olvad, optikai 45 forgatóképessége: [«]D = +26,7° (koncentráció: 1,0%, vizes oldat). Elemanalízis: a C21 H 41 N 5 O u .2H 2 CO s képletre számított: C 41,63 H 6,83 N 10,55%; 50 mért: C 41,52 H 6,47 N 10,47%. A Bu 1975 antibiotikum-keverék összetevőinek vékonyrétegkromatográfiás vizsgálata 4. táblázat Réteg Oldószerelegy Ráérték Módszer Réteg Oldószerelegy At A2 Q c2 S 110* S 117 S 115** Szilikagél szilikagél alumíniumoxid CHC13 —CH 3 OH—28%-os NH 4 OH—H 2 C(1:4:2:1) CHCI3—CH3 OH—28%-os NH 4 OH (1:3:2) CHCI3—CH3 OH—28%-os NH 4 OH (2:1:1) 0,41 0,20 3,7cra 0,41 0,20 0,2cm 0,51 0,26 5,3cm 0,51 0,26 0,5cm * Háromszor futtatva. ** 16 órán át tartó futtatás, a foltoknak a kiindulási ponttól való távolságát cm-ben adjuk meg. 5
