166346. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rapamicin előállítására
9 166346 10 Termelő szakasz: Az antibiotikumtermelő fermentációt automatikus habzásgátló-adagolóval és pH-jelölő és -szabályozó készülékkel felszerelt, New Brunswick Model F—250 típusú, 250 literes fermentorokban végezzük. A fermentorokba 160 liter 8 KM jelű vizes termelőközeget töltünk, amelynek összetétele a következő: oldható keményítő 1,0% (NH4 ) 2 S0 4 0,5% K2 HP0 4 0,5% glükóz (cerelóz) 1,5% MgS04 0,025% ZnS04 0,005% MnS04 0,001% FeS04 • 7H2 0 0,002% CaCOs 0,2% „Blackstrap" melasz 0,5% hidrolizált kazein [NZ—Case, a Sheffield Chemical cég (Norwich, New York] terméke] 0,5% szalonnaolaj [Larex No. 1, a Swift Canadian Co. (Toronto) cég terméke] 0,2% A táptalaj pH-ja 7,1 és 7,3 közötti érték. A fermentorokba töltött táptalajt 45 percig 121 C°-on sterilizáljuk, majd a táptalajt lehűtjük, és beoltjuk az 1. fázisú inokulummal. A beoltáshoz egy lombik tartalmát (2% inokulum) használjuk fel. Az elegyet 28 C°-on inkubáljuk, eközben 0,5 térfogatrész/térfogatrész Xperc sebességgeLlevegőztetjük, és 250 fordulat/perc sebességgel keverjük. Az elegy rapamicin-koncentrációja (Candida albicans-szal beoltott agar-lemezekkel végzett biológiai mérés alapján) 5 nap elteltével körülbelül 20 [xg/ml értéket ér el. Ekkor a fermentációt leállítjuk, és az antibiotikumot az alábbi módszerek egyikével elkülönítjük. Extrakció: a) A fermentlevet 2X1 térfogatrész n-butanollal extraháljuk. Az n-butanolos oldatokat egyesítjük, 1 térfogatrész vízzel mossuk, vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot 3X2 liter metanollal extraháljuk. A metanolos oldatokat egyesítjük, diatómaföldön („Celite") bocsátjuk át, és a kapott oldatot szárazra pároljuk. Nyers rapamicint tartalmazó, olajos maradékot kapunk. ; b) A fermentlevet diatómaföldön („Celite") szűrjük. A szűrletet 2X1 térfogatrész etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos oldatokat egyesítjük, 1 térfogatrész vízzel mossuk-, vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk, és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 2 «= 1 liter metanollal extraháljuk, és a metanolos oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk. Nyers rapamicint tartalmazó, olajos maradékot kapunk. c) A b) módszer szerint elkülönített micéliumot 1—2 térfogatrész vízzel mossuk, majd a nedves micéliumot a micélium súlyára számított 3X5 térfogatrész metanollal extraháljuk. A metanolos oldatokat egyesítjük és csökkentett nyomáson kis térfogatra bepároljuk. A kapott vizes maradék körülbelül 10 térfogat % metanolt tartalmaz. Ezt a vizes maradékot 3X1 térfogatrész metilénkloriddal extraháljuk. A metilénkloridos oldatokat egyesítjük, vízmentes nátriumszulfát fölött szárítjuk, 5 és bepároljuk. Olajos maradékot kapunk. Az olajos maradékot 1 térfogatrész petroléterrel hígítjuk, és az elegyhez 30 vegyes-% csontszenet (Darco G60) adunk. Az elegyet 0,5 órán át keverjük, majd szűrjük. A csontszenet — amely a terméket lényegében teljes 10 egészében megkötötte — 2X1 térfogatrész petroléterrel mossuk, majd a csontszén súlyára számított 3X5 térfogatrész 50:50 arányú metilénklorid-éter eleggyel eluáljuk. A metilénklorid-éteres oldatokat egyesítjük, szárazra pároljuk, és a maradékot kevés éterben oldjuk. 15 Az éteres oldatból hideg petroléterrel kicsapjuk a nyers terméket. Eljárhatunk úgy is, hogy a fenti extrakciós műveletek bármelyikével kapott olajos maradékot 1 térfogatrész hexánnal hígítjuk, és a kapott elegyet preparatív méretű 20 szilikagél G oszlopon bocsátjuk át. Az oszlopot — amely a terméket lényegében teljes egészében megkötötte — néhány térfogatrész hexánnal és 50: 50 arányú hexán-éter eleggyel mossuk, majd éterrel eluáljuk. Az éteres oldatot kis térfogatra bepároljuk, és a nyers ter-25 méket hideg petroléterrel kicsapjuk. Tisztítás 30 A fenti műveletekben kapott nyers terméket 50: 50 arányú hexán-éter elegyben oldva szilikagél G oszlopon (Merck) kromatografáljuk. Eluálószerként étert használunk. Az éteres oldatot kis térfogatra bepároljuk, és a tisztított rapamicint petroléterrel kicsapjuk. Éteres 35 kristályosítás után analitikai tisztaságú rapamicint kapunk; qp.: 183—185 C°. 2. példa 40 A Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzs tenyésztését és a spórák elkülönítését az 1. példában leírt módon végezzük. Az 1. fázisú inokulum előállításához a következő 45 összetételű, 7,1 és 7,3 közötti pH-értékű táptalajt használjuk fel: szójababliszt („Special X", az Archer—Daniels Co., Midland, 50 , Michigan cég terméke) 4 vegyes% glükóz (cerelóz) 2 vegyes% ammóniumszulfát 0,3 vegyes% kalciumkarbonát 0,15 vegyes% víz , ad 100 ml 55. 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba 100—100 ml táptalajt töltünk, a lombikokba töltött táptalajt 35 percig 121 C°-on sterilizáljuk, majd 25 C°-ra hűtjük, és az 1. példa szerinti spóraszuszpenzió 4%-ával (4 ml) beoltjuk. 60 A lombikokat 24 órán át rázógépen (lökethossz: 5 cm, fordulatszám: 240/perc) 25 C°-on inkubáljuk. A 2. fázisú inokulumot a következőképpen állítjuk elő: 24 literes, laposfenekű lombikba 3,2—3,2 liter, az 1. fázisú inokulum előállításánál ismertetettel azonos 65 összetételű, 7,1 és 7,3 közötti pH-értékű táptalajt töl-5.-,
