166346. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rapamicin előállítására

11 166346 12 tünk, és a táptalajt 35 percig 121 C°-on sterilizáljuk. A lombikokat az oldhatatlan anyag újraszuszpendálása céljából felrázzuk, majd további 45 percig sterilizáljuk. A lombikokba töltött táptalajt 25 C°-ra hűtjük, 64 ml 1. fázisú inokulummal oltjuk be, majd 18 órán át rázógépen (fordulatszám: 65/perc, lökethossz: 10 cm) 25 C°-on inkubáljuk. Termein szakasz: Az antibiotikumtermelő fermentációt automatikus habzásgátló-adagolóval és pH jelölő és -szabályozó készülékkel felszerelt, New Brunswick F—250 típusú, 250 literes fermentorokban végezzük. A fermentorokba 160 liter vizes termelőközeget töltünk, amelynek összetétele a következő: szójababliszt („Special X", az Archer-Daniels Co., Midland, Michigan cég terméke) glükóz (cerelóz) ammóniumszulfát dikálium-hidrogénfoszfát „DF—143 PX" habzásgátló (a Mazer Chemicals Inc., Gurnee, Illinois cég terméke) 3 vegyes% 2 vegyes % 0,1 vegyes% 0,5 vegyes % 0,005vegyes% A fermentorokba töltött táptalajt 30 percig 121 C°-on sterilizáljuk, majd lehűtjük, és a táptalaj pH-ját ammóniumhidroxiddal 5,8 és 6,2 közötti értékre állítjuk be. Ezután a táptalajt beoltjuk a 2. fázisú inokulummal. A beoltáshoz egy lombik tartalmát (2% inokulum) használjuk fel. Az elegyet 25 C°-on inkubáljuk, eközben 0,25 térfogatrész/térfogatrész x perc sebességgel levegőztetjük, és 200 fordulat/perc sebességgel keverjük. A fermentlé pH-ja 30—35 óra elteltével csökkenni kezd; ekkor a fermentlé pH-ját az automatikus pH-szabályozó segítségével, ammóniumhidroxid időnkénti beadagolásával a fermentáció lezajlásáig 6,0 értéken tartjuk. Körülbelül 48 óra elteltével a fermentlé glükóz-koncentrációja kb. 0,5%-ra csökken, ekkor a fermentléhez folyamatosan napi 3,75 térfogat% 40< -os glükóz-oldatot vezetünk. A glükóz adagolását a fermentáció lezajlásáig folytatjuk. Az elegy rapamicin-koncentrációja (Candida albicans-szal beoltott agar-lemezekkel végzett biológiai mérés alapján) 4= 5 nap elteltével körülbelül 60 [ig/ml értéket ér el. Ekkor a fermentációt leállítjuk, és az elegyből az alábbi módszerrel elkülönítjük az antibiotikumot. A fermentlevet a micéliumok elkülönítése céljából Celite-n szűrjük. Három fermentorból elkülönített, 400 liter össztérfogatú fermentléből körülbelül 60 kg nedves mieéliumot különítünk el. A nedves micéliumot súlyára vonatkoztatva 1 térfogatrész metanollal keverjük össze, és a keveréket 2 térfogatrész triklóretánnal kétszer extraháljuk, így körülbelül 250 liter triklóretános extraktumot kapunk, amely körülbelül 22—24 g rapamicint tartalmaz. A triklóretános extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott 1—1,4 kg olajos maradékot lassú ütemben, keverés közben 5 térfogatrész acetonhoz adjuk, és a kivált csapadékot szűréssel eltávolítjuk. Az acetonos oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot először 2 térfogatrész, majd 1 térfogatrész metanollal extraháljuk. A metanolos extraktumokat egyesítjük és szűrjük, az olajos maradékot pedig döntjük. A rapamicint tar-5 talmazó metanolos extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A kapott 200—300 g olajos maradékot 1 súlyrészre vonatkoztatva 5 térfogatrész 15%-os acetonos hexánban oldjuk. Az oldathoz a feloldott olajos maradék súlyának kétszeresét kitevő mennyiségű 10 szilikagélt (Merck) adunk, és az elegyet körülbelül 1 órán át keverjük. Az elegyet zsugorított üvegszűrőn szűrjük, és a szűrletet elöntjük. A rapamicint tartalmazó szilikagélt 15 % acetont tartalmazó hexánnal többször mossuk, majd 30% acetont tartalmazó hexánnal eluáljuk. Az 15 eluatumot szárazra pároljuk, a kapott, körülbelül 60—150 g száraz maradékot éterben oldjuk, és a tiszta rapamicint kristályosítással elkülönítjük. A fenti eljárással körülbelül 24 g nyers rapamicinből körülbelül 10—14 g tiszta, kristályos terméket állithatunk elő. 20 Szabadalmi igénypontok 25 1. Eljárás rapamicin előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzset aerob körülmények között, asszimilálható szén- és nitrogén-forrást és ásványi sókat tartalmazó vizes táptalajon tenyésztünk, a rapamicint elkülönítjük a fermentlé-30 bői, és a kapott terméket kívánt esetben tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 20—35 C°-on, 5,8 és 7,5 közötti pH-értéken végezzük. 35 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a rapamicin elkülönítése során a) a fermentlevet vízzel nem elegyedő oldószerrel 40 extraháljuk, az így kapott extraktumot betöményítjük, és a kapott maradékot vízzel elegyedő oldószerrel extraháljuk, vagy b) a fermentléből elválasztjuk a micéliumot, a micé-45 lium-mentes fermentlevet vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk, a kapott extraktumot betöményítjük, és a maradékot vízzel elegyedő oldószerrel extraháljuk, vagy 50 c) a fermentléből elválasztjuk a micéliumot, a micéliumot vízzel elegyedő oldószerrel extraháljuk, a kapott extraktumot betöményítjük, és az így kapott vizes maradékot vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk, vagy 55 d) a fermentléből elválasztjuk a micéliumot, a micéliumot vízzel elegyedő rövidszénláncú alkanollal ele^ gyítjük, az elegyet vízzel nem elegyedő oldószerrel extraháljuk, a kapott extraktumot bepároljuk, a kapott olajos maradékot rövidszénláncú alifás ketonnal extra-60 háljuk, az extraktumot szűrjük, a szűrletet bepároljuk, és a kapott olajos maradékot vízzel elegyedő rövidszénláncú alkanollal extraháljuk, majd az a) — d) műveletsorok bármelyikével kapott extraktumot szűrjük, a szűrletet betöményítjük, és az 65 így kapott nyers rapamicint kívánt esetben tisztítjuk. 6