166346. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rapamicin előállítására
166346 dáül éterben, etílacetátban vagy benzolban oldjuk, és az antibiotikumot valamely nem-poláris oldószerrel, például petroléterrel, hexánnal vagy pentánnal kicsapjuk. Az így kapott terméket kívánt esetben oszlopkromatográfiás módszerrel tovább tisztíthatjuk; adszorbensként célszerűen szilikagélt használhatunk. A kromatografálás során kapott rapamicint éterből kristályosíthatjuk. Az alábbiakban a rapamicin fizikai állandóit és azonosítási adatait közöljük. a) A tisztított rapamicin színtelen, kristályos termék; éteres átkristályosítás után 183—185 C°-on olvad. b) A rapamicin éterben, kloroformban, acetonban, metanolban és dimetilformamidban oldódik, hexánban és petroléterben igen rosszul oldódik, és vízben lényegében oldhatatlan. c) A rapamicin szilikagél-vékonyrétegen (E. Merck A. G., Darmstadt) kromatografálva egyetlen foltot ad. A vékonyrétegkromatográfiásan meghatározott Rd-értékek a következők: 0,42 (40: 60 arányú éter-hexán elegygyel futtatva), 0,5 (15: 85 arányú izopropanol-benzol eleggyel futtatva), és 0,43 (20: 80 arányú etanol-benzol eleggyel futtatva). d) Az egymás utáni fermentációs műveletekben kapott rapamicin-minták elemzési adatai a következők: 1. táblázat C% H% N°/o 67,24 66,14 67,26 66,72; 8,93 8,72 8,92 8,9; 1,39 1,37 1,28 1,38. Az elemzési adatok átlagértékei a következők: C: 66,84%, H: 8,84%, N: 1,37%. e) A rapamicin 95%-os etanolban felvett ultraibolya abszorpciós spektrumában a következő jellemző sávok jelennek meg: 267 nm (E}'^=417), 277 nm (E}°^ = 541) és 288 nm (Ej^m =416). f) A rapamicin kloroformban felvett infravörös abszorpciós spektrumát az 1. ábrán mutatjuk be. A spektrumban 3560, 3430, 1730, 1705 és 1630—1610 cm"1 hullámszám-értékeknél jelenik meg jellemző sáv. A rapamicin infravörös abszorpciós spektrumában megjelenő további sávokat az alábbiakban soroljuk fel. Az egyes számadatok után zárójelbe tett betűjelzések jelentése a következő: e=erős, k= közepes, gy = gyenge. Ez az osztályozás önkényes; az lenyelési sávot akkor tekintjük erősnek, ha az abszorpció maximuma nagyobb az azonos tartományban jelentkező háttér-abszorpció 2/3-ánál; közepes az elnyelési sáv, ha az abszorpció maximuma az azonos tartományban jelentkező háttér-abszorpció 1/3—2/3-ának felel meg, míg az elnyelési sáv gyenge, ha az abszorpció maximuma az azonos tartományban jelentkező háttér-abszorpció 1/3-ánál kisebb. Az infravörös abszorpciós spektrum sávjai tehát a következők: 2990 (k), 2955 (e), 2919 (e), 2858 (e), 2815 (k), 1440 (e), 1365 (k), 1316 (k), 1272 (k), 1178 (e), 1158 (k), 1129 (e), 1080 (e), 1060 (e), 1040 (k), 1020 (k), 978 (e), 905 (k), 888 (gy) és 866 (gy) cm-1 . g) A rapamicin mágneses magrezonancia-spektrumát a 2. ábrán mutatjuk be. h) A rapamicin különféle mikroorganizmusokkal szemben meghatározott minimális gátló koncentrációit (MGK) az 1. táblázatban soroljuk fel. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Mikroorganizmusok MGK g/ml Candida albicans (5 törzs) 0,02—0,1 Candida catenulata <0,1 Candida lipolytica 2,5 Candida stellatoidea -=0,1 Candida tropicalis 0,1 Candida pseudotropicalis =-5,0 Candida parapsilosis -=0,1 Candida morrera ^0,1 Candida intermedia <0,1 Microsporum gypseum 12,5 Trichophyton mentagrophytes >1000 (i) A rapamicin egéren meghatározott LD50-értéke intraperitoneális adagolás esetén 597,3+28,1 mg/kg, orális adagolás esetén pedig >2500 mg/kg. A rapamicin által kiváltott védőhatás vizsgálata során egereket intravénás injekcióban Candida albicans ATCC 11651 törzzsel fertőzünk meg, majd az egereknek a megfertőzés után 1, 4, illetve 24 órával szubkután úton 10 mg/kg rapamicint adunk be. Ez a hatóanyagmennyiség az egerek 50%-án idéz elő védőhatást. 25 mg/kg-os szubkután dózissal teljes védelmet biztosíthatunk. Ha a fenti kísérletben a rapamicint orálisan 10 mg/kg-os dózisban adagoljuk, a fertőzést a vizsgált 10 egér közül 4 éli túl, míg a 25 mg/kg-os orális dózis teljes védelmet biztosít. Rapamicin 1,5% polysorbate 80-at (Tween 80-at) tartalmazó vízzel készített 1%-os szuszpenzióját intradermálisan nyúl fülébe fecskendezzük. 0,2 ml szuszpenzió befecskendezése nem okoz irritációt. Irritációt akkor sem észlelünk, ha nyúl szemébe 2 csepp 0,5%-os vizes rapamicin-szuszpenziót cseppentünk. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa A mikroorganizmus előkészítése : Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 törzset zabliszt-paradicsompép-agar ferde tenyészeten (T. G. Pridham és munkatársai: Antibiotic Annual 1956—1957, Medical Encyclopedia Inc., New York, 947. oldal), illetve Roux-lombikban ugyanezen a táptalajon tenyésztünk. 7 napig 28 C°-on végzett inkubálás után jó növekedés észlelhető. Az egyik Roux-lombikból mosással elkülönítjük a spórákat, és a spórákat 50 ml steril desztillált vízben szuszpendáljuk. Az így kapott szuszpenziót használjuk fel az 1. fázisú inokúlum beoltásához. Az 1. fázisú inokúlum előállításához a következő öszszetételű, 7,0 pH-értékű táptalajt használjuk fel: 0,4% Emerson-táptalaj (R. L. Emerson és munkatársai: J. Bacteriol. 52, 357 (1946)], 0,4% pepton, 0,25% nátriumklorid, 0,1% élesztőkivonat és 1% glükóz. A táptalajt lombikokba töltjük, a lombikokat a fenti spóraszuszpenzió 1%-ával beoltjuk, majd a lombikokat 30 órán át rázógépen (fordulatszám: 65/perc; lökethossz: 10 cm) 28 C°-on inkubáljuk. 4
