165957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav előállítására fermentációval
5 165957 5 vegyület amfoter tulajdonságú, látszólagos izoelektromos pontja 3,5 pH körül van, és oldata 1,5—9,0 pH értéktartományban stabil. Az I. képletű „antibiotikum" (842A-val jelzett vegyület) és sói nemcsak a penicillinázzal, de a cefalosporinázokkal szemben is ellenáll. E vegyület aktív ellenállást fejt ki a Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusok szaporodásával szemben. A viszonylag kis baktériumölő aktivitású cefalosporin C-vel ellentétben a találmány tárgyát képező I. képletű antibiotikum és sói jelentős „in vivo" Gram-negatív hatást fejtenek ki a cefalotint általában jóval felülmúló aktivitással. Ez az aktivitás „in vivo" hatékonyságban nyilvánul meg a Proteus morganii-vel szemben, hatékony továbbá a következő Gram-negatív baktériumokkal szemben is: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae, AD, Klebsiella pneumoniae B, és Paracolobactrum arizonae. Az antibiotikum biológiai értékelését korongvizsgálatokkal végezzük. A vizsgálatok céljaira 9,5 mm méretű szűrőpapír korongokat használunk. A vizsgálati lemezek készítéséhez Difco tápagart és 2,0 g/liter Difco élesztőextraktumot (Difco Company, Detroit, Michigan) használunk lemezenként 10 ml mennyiségben. A vizsgálati mikroorganizmus, Vibrio percolans ATCC 8461 egy éjszaka alatti szaporulatát steril sóoldatban 660 mu hullámhosszon 40%-os transzmissziót mutató szuszpenzióra hígítjuk. E szuszpenzióból a lemezekre öntés előtt literenként 20 millilitert adunk a közeghez. A vizsgálati korongokat felhasználásukig — de legfeljebb 5 napig - 4C° hőmérsékleten tartjuk. Az antibiotikummal telített vizsgálati korongokat alkalmazás előtt 8—24 óra hosszat 28 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A gátlási zónákat mm átmérőben olvassuk le. Ezek a relatív hatás megállapítására szolgálnak, vagy a hatást a tisztított sztandard anyaggal való összehasonlítással, jug/ml-ben is kifejezhetjük. A tiszta 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)-3-- (ka rb a moiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsavnak a fermentleben levő nagy mennyiségű szennyezéstől való elkülönítésével járó nehézségek miatt nagy jelentősége van annak, hogy módot találjunk a fermentlé összmennyiségéhez képest az antibiotikum koncentrációjának növelésére. Ennélfogva a jelen találmány egyik tárgya eljárás az antibiotikum hozamnövelésére a fermentálás folyamatában. A találmány további tárgya olyan módszer, amelynek során az antibiotikum hozamának növelésére a fermentálás folyamatában viszonylag olcsó, könnyen hozzáférhető kémiai adalékanyagokat használunk. A találmány további tárgyai nyilvánvalóvá válnak. Rájöttünk arra, hogy a nátriumtioszulfát (Na2 S2 03 ) a nátriumditionit (Na 2 S 2 04), a-aminoadipinsav, vagypedig az a-aminoadipinsav és nátriumtioszulfát együttes adagolása a kémiailag definiált és a komplex szerves fermentáló közegekhez fokozza a 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido)- 3 -(karbamoiloximetil>7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav termelését. A jelen találmány szövegében használt „komplex szerves közegek" kifejezésen olyan közegeket értünk, amelyekben nem minden alkotórész kémiailag definiált. Ilyen például „Crescent brand 5 outs"-ból (Fruen Milling Company, Minneapolis), a zabból, szójabablisztből, nátriumcitrátból, habzásgátlóból és desztillációs maradékokból álló közeg. A „kémiailag definiált" vagy a „szintetikus" közeg kitételen olyan közegeket értünk, melyek 10 minden alkotórésze kémiailag meghatározott. Ilyen például a kukoricakeményítőből, kálium-(savas)-foszfátból, nátriumcitrátból, aszparaginból, metioninból, mononátrium-glutamátból, kalciumkloridból, magnéziumszulfátból és vas(II)szulfátból 15 álló közeg. Az antibiotikum termelését serkentő nátriumtioszulfát és/vagy a-aminoadipinsav vagy nátriumditionit alkalmazott mennyisége egyrészt a tenyészettől, másrészt az alkalmazott közegtől függ. 20 A Streptomyces lactamdurans tenyészet esetében az antibiotikum hozamnövekedése 0,005-1,6% (súly/térfogat) adalékanyagot tartalmazó szintetikus közegben bekövetkezik. A jó antibiotikum-termelés elérésére előnyös azonban 0,1-0,8% adalék-25 anyag alkalmazása. Optimális hozamokat 0,3—0,5% mennyiségű adalékanyaggal, és kiemelkedő hozamot 0,4% adagolása esetén érünk el. Nátriumditionit vagy nátriumtioszulfát adagolása szintetikus vagy kémiailag definiált közeghez, Strepto-30 myces lactamdurans-szal a 7-(D-5-amino-5-karboxivaleramido>3-(karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav termelését 91-105%-kal megnöveli, amennyiben a nátriumtioszulfát 0,4%-os koncentrációban van jelen. A nátriumtioszulfát és nát-35 riumditionit 1,6%-ot meghaladó koncentrációi az antibiotikum termelődését a közegben csökkenteni hajlamosak. A fentieknek megfelelően komplex szerves tápközegben Streptomyces lactamdurans használatával 40 az antibiotikum optimális hozama 0,05—0,1% nátriumtioszulfát vagy nátriumditionit szint esetén figyelhető meg. Azt találtuk még, hogy a nátriumtioszulfát és a DIxK-amino-adipinsav kombinálva a Strepto-45 myces lactamdurans-szal serkenti az antibiotikum termelést a szintetikus és a komplex közegekben egyaránt. A nátriumtioszulfát mennyisége - amint erre az előbbiekben utaltunk — a hozzáadott DL-a-aminoadipinsawal együtt 0,005-0,15% 50 (súly/térfogat) határok között mozog. A DL-a-aminoadipinsavat előnyösen mintegy 0,01% (súly/térfogat) mennyiségben adagoljuk, a nátriumtioszulfát és DL-a-aminoadipinsav kombinált optimális adagja 0,4%, illetve 0,01%. A hozam-55 növekedés a legfigyelemreméltóbb szintetikus közegben, de a komplex szerves közegben is fokozott termelés érhető el a megfelelő kontroli-fermentálásokhoz képest. Meglepő, hogy az alkalmazott Streptomyces 60 lactamdurans tenyészet esetében a hozamnövelő adalékanyag fermentléhez adagolásának ideje kritikus. Ha például a nátriumtioszulfát és/vagy DL-a-aminoadipinsav vagy nátriumditionit adagolását a beoltás után 24-48 órával végezzük, opti-65 malis hozamokat érünk el. Ha azonban az ada-3
