165816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldhatatlan, a bőr által elviselhető szárított enzim adduktok előállítására - mosószerként

165816 enzim-addukttal nem lépnek fel. Minthogy már az előállítás során a bőrt nem-irritáló enzim-polifenol addukt képződik, a bőrfertőzés veszélyét kiküszöböltük. Az alábbi teszttel igazoljuk, hogy a találmányunk szerinti vízoldhatatlan enzim-adduktot a bőr elviseli: 50 mg, az 1. példa szerint előállított enzim-tanninadduktot (enzim-aktivitás 150.000 DU) por alakban 2,5X2,5 cm nagyságú cellulózdarabkákra felviszünk, illetve azonos nagyságú cellulóz-darabkákat 0,5 ml, 450 000 DU aktivitású enzim-tannin addukt szuszpenzióval átitatunk. Az ily módon kezelt cellulózból készített tapaszt ragasztószalag segítségével hím nyulak (fehér újzélandi fajta, átlagos súly 2500 g) borotvált bőrére erősítjük. Egyidejűleg kontrollállatok bőrére hasonló módon oldható proteázzal (kereskedelmi termék, OptimaseR) kezelt tapaszokat rögzítünk. A tapaszokat 24 óra múlva eltávolítjuk és a kezelt bőrfelületeket az alábbi skála alapján értékeljük: Vörösödés nem lép fel Gyenge vörösödés Jól elhatárolt vörösödés Közepes-nagymérvű eritmea Súlyos ödéma, varasodással megfigyeljük és újra értékeljük, kelő személyek a tapasz helyét nem ismerték, összesen 6 kísérleti állatot alkalmaztunk. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza. 10 15 20 Másrészről meglepő módon azt találtuk, hogy a találmányunk szerinti termékek a mosóvízben teljes aktivitásukat kifejtik. A mosóvízben uralkodó körülmények mellett a pH-értéknek megfelelő enzimaktivitás lép fel, azaz a teljes kiindulási enzim-aktivitás felszabadul. A találmányunk szerinti termék pH-függésének meghatározása céljából az enzim-tannin-adduktot kétszeresen desztillált vízbe visszük és az aktivitást 15 perc múlva meghatározzuk. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat Az oldhatatlan enzim-addukt aktivitásának píMüggése pH Talált aktivitás DU/ml Oldatba ment aktivitás a kiindulási aktivitás %-a 0 Ödéma nincs 1 Kis ödéma 5 276 000 6 2 Jól elhatárolt ödéma 6 345 000 8 3 Közepes ödéma 7 1 210 000 27 4 Súlyos ödéma 25 8 2 952 000 64 9 3 578 000 79 kezelt helyeket ismét 9,5 4 485 000 100 . A kísérletet kiérté-1. Táblázat Oldható és oldhatatlan proteázok bőrizgató hatása Alkalmazás Oldható enzim Oldhatat-Alkalmamegkezdése 6 nyúlon kapott óta eltelt pontszámok : lan enzimtannin zás órák száma összege addukt. 6 nyúlon kapott pontok összege Por Tapasz 150 000 DU 24 h 48 h 13 5 5 0 72 h 6 0 96 h 1 0 120 h 2 0 Szuszpenzió Tapasz 450 000 DU 24 h 48 h. 10 6 6 0 72 h 8 0 96 h 4 0 120 h 2 0 A fenti eredmények egyértelműen igazolják, hogy a találmányunk szerinti oldhatatlan enzim-addukt a bőrt alig támadja meg, míg az oldható proteáz jelentős bőrizgató hatást mutat, mely csak hosszabb idő után múlik el. 30 Találmányunk további részleteit a példákban ismertetjük anélkül, hogy azt a példákra korlátoznák. 1. példa 100 liter 25 C° hőmérsékletű szűrt fermentléhez 35 [mely Bacillus subtilisből származó alkalikus proteázt tartalmaz 36800 DU/ml koncentrációban: összfehérje-tartalom 10 g/l] 5,5 pH-értéken 600 g tannint adunk. A szűrést 30 perc múlva szűrőprésen végezzük el. Az enzim-tannin adduktot vízzel mossuk, a hozzá-40 tapadt víztől acetonnal megszabadítjuk, majd vákuumban 45 C°-on szárítják. Kitermelés: 750 g beigeszínű, oldhatatlan proteázenzim-addukt, aktivitás 3.340.000 DU/g = a kezdeti aktivitás 68%-a. A szokásos nátriumszulfátos eljárással 45 elérhető kitermelés 60%, a kitermelés-javulás tehát jelentős. 2. példa 1 liter szűrt fermentlevet [Bacillus subtilisből 50 származó proteáztartalmú a-amiláz aktivitás 5000 DUN/ml, összfehérjetartalom 10 g/l] pH = 6 értéken 10 g tannin vizes oldatával elegyítünk. Azonnal pelyhes, jólszűrhető csapadék képződik, melyet vízzel majd acetonnal mosunk és végül vákuumban 45 C°-on 55 szárítunk. Kitermelés: 7,2 g aktivitás 436000 DUN/g = a kiindulási érték 63%-a. 3. példa 1 liter élesre szűrt oldatot (összfehérjetartalom 10 60 g/l, bakteriális proteázt és a-amilázt tartalmaz 92000 DUN/ml és 400 DUN/ml koncentrációban) 5,5 pH-értéken 8 g tannin és 100 ml víz oldatával elegyítünk. A világos pelyhes csapadékot szűrjük, és vízzel mossuk. Vákuumban történő szárítás után 65 világos, majdnem szagtalan port kapunk. 3