165728. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid ipari méretű foszforilálására alkalmas NAD-kináz enzimkészítmény előállítására
3 165728 4 gyakorlati tapasztalat, hogy ipari méretekre nagyítva az enzim előállítását, az így előállított enzimkészítménnyel korántsem érhető el olyan jó konverzió, mint amit a szabadalmi leírás megad. Ez nemcsak azért jelent problémát, mert a hozam csökken, de a reakcióelegyben nagy menynyiségben visszamaradó NAD a reakcióelegyben levő komponensek ioncserélő szétválasztását is megnehezíti és hatásfokát lerontja. Hátránya továbbá a 157 298 lsz. magyar szabadalom szerinti eljárásnak, hogy a bázikus fehérjére történő szelektív adszorpció kivitelezése iparilag megbízhatatlan és igen nagy enzimveszteséget okoz. Továbbá hátránya az eljárásnak, hogy ipari kivitelezésben a kinyert enzimkószítmény specifikus aktivitása ós összaktivitása nagy mértékben ingadozik. Végül hátránya az eljárásnak, hogy a jelenlevő ATP-áz szennyezés miatt az intermedierek aktivitása nem mérhető és így nem állapítható meg a hőkezelés előtti tisztítási lépéseknél fellépő veszteségek nagysága. A találmány célja ipari kivitelezésben is megbízható, jó hozamot és olyan enzim kinyerését biztosító eljárás kidolgozása, amely a NAD ipari méretekben történő foszforilálását gazdaságosan, könynyen kivitelezhetően és biztonságosan oldja meg. A találmány alapja az a felismerés, hogy a zavaró ATP-áz hőkezeléssel történő inaktiválása az előzetes adszorpciós és/vagy kisózásos tisztítás nélkül közvetlen a csirkemáj vizes extraktumában is elvégezhető, ha ez extraktumhoz megfelelő puffer jelenlétében kis koncentrációban NAD-ot is adunk. Ez a felismerés azért meglepő, mert NAD jelenléte nélkül az extraktumban levő NAD-kináz enzim a hőkezelés során denaturálódik. Továbbá meglepő azért is, mert az extraktumban még jelen vannak azok a NAD-kinázra inaktiválóan ható anyagok, amelyeket a 157 298 lsz. magyar szabadalomban leírt eljárás a bázikus fehérjékre való adszorpcióval távolít el. A találmány alapja továbbá az a felismerés is, hogy az enzimhatást zavaró ATP-áz aktivitás már az extraktum hőkezelésével is megszüntethető a szabadalomban leírt hőmérsékleti és időtartományok mellett. Ez a felismerés azért is meglepő, mert az extraktumban levő nagy menynyiségű egyéb fehérje a hődenaturálással szemben bizonyos védőhatást fejthet ki, de ez a védőhatás a tapasztalatok szerint a zavaró ATP-ázra nem terjed ki. Végül a találmány alapja az a felismerés, hogy ha a hőkezelést a megadott körülmények között közvetlenül az extraktumban végezzük, ez a denaturálódott csapadék eltávolítása után egymaga olyan nagyfokú tisztítást eredményez, hogy a bázikus fehérjékre történő specifikus adszorpció teljesen feleslegessé válik. Ez viszont azért meglepő, mert a 157 298 lsz. magyar szabadalom szerinti eljárásban mindkét lépésre szükség van a megfelelő specifikus aktivitás eléréséhez. A találmány eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid ipari méretű foszforilálására alkalmas kináz enzimkészítmény előállítására csirkemájból vízzel vagy vizes sóoldattal történő extrakció, az extraktum hőkezelése és az oldatban maradt fehérjéktől a NAD-kináz aktivitással rendelkező fehérjók elválasztása útján. A találmány lényege 5 az, hogy az extraktumhoz nikotinamid-adenindinukleotidot adunk, és közvetlenül ennek hozzáadása után az extraktumot hőkezeljük. A hőkezelést 60—72 °C, előnyösen 65—68 °C hőmérsékleten végezzük. Az extraktumhoz 0,001—0,ls%, 10 célszerűen 0,01—0,02s% nikotinamid-adenin-dinukleotidot adunk. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy a megdarált csirkemájból kalciumklorid vizes oldatával extraktumot készítünk, s mechani-15 kai szennyezésektől, szövetmaradékoktól megtisztított extraktumot puffer jelenlétében a NAD hozzáadása után 60—72 °C-ra melegítjük, a kicsapódott fehérjék eltávolítása után a NAD-kináz enzimet ammóniumszulfátos frakcionálás-20 sal tovább tisztítjuk, majd a kapott aktív frakciót puffer és NAD jelenlétében sótalanítjuk. A nyert oldat NAD-foszforilálásra közvetlenül felhasználható, vagy 0—5 °C-on hetekig tárolható lényegében aktivitásveszteség nélkül, vagy lefagyasztható 25 és liofilizálható. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa 30 30 kg csirkemájat hűsdarálón ledarálunk, hozzáadunk 50 1 0,02 mólos CaCl2 oldatot, +5 °C-ra hűtjük, késes homogenizátorral homogenizáljuk és jég között fél órán át kevertetjük. A szövetmaradékot ülepítő centrifugával 90 percig tartó 35 pörgetéssel eltávolítjuk, majd a NAD-kináz aktivitás zömét tartalmazó kb. 40 liter térfogatú felülúszóhoz 20 1 olyan 0,1 mólos pH = 7,5 glicilglicin puffert adunk, amelyben 10 g NAD van feloldva. Az így elkészített oldatot 25 perc alatt 67,5 °C-ra 40 melegítjük fel, és 30 percen keresztül ezen a hőmérsékleten tartjuk ( + 0,5 °C). Ezután hőcserélőn gyorsan 5—10 °C hőmérsékletre hőtjük, a kicsapódott fehérjéket MSE Mistral hőthető centrifugán centrifugálással eltávolítjuk. A tiszta felül-45 úszó térfogata 40 liter. A felülúszóhoz 7,85 kg szilárd ammóniumszulfátot adagolunk lassan keverés közben (0,33 telítés), a kicsapódott fehérjéket egy éjszakán keresztül ülepedni hagyjuk, majd centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót (50 1) 50 tovább telítjük 0,55-re 7,1 kg szilárd ammóniumszulfát adagolásával. A NAD-kináz aktivitás zömét tartalmazó kicsapódott fehérjéket centrifugálással összegyűjtjük, a felülúszókat elöntjük. A csapadékot egy liter 0,05 mólos pH = 7,5 55 és 0,01 s% NAD-ot tartalmazó glicilglicin pufferben feloldjuk, és a fenti pufferrel Akrilex P4-gyel töltött oszlopon sómentesítjük. Az oszlopról lejövő frakció 30 000 E-nyi NAD-kináz aktivitást tartalmaz összesen. A kinyert enzimmel 28 óra 60 alatt NAD és ATP tartalmú reakcióelegyben NADP előállításánál 73,5 %-os konverziót lehet elérni az alábbi körülmények között: Egy liter desztillált vízben feloldunk 10 g mag-, néziumkloridot, 257 g NAD-t, 164 g ATP-t, 2 g 65 EDTA Na2 -t. Az oldat pH-ját 10 n NaOH-val 2
