165728. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid ipari méretű foszforilálására alkalmas NAD-kináz enzimkészítmény előállítására
165728 5 6 7-re állítjuk. Hozzáadunk az 1—5. példa valamelyike által készített enzimkészítményből 35 000 E NAD-kináznak megfelelő mennyiséget és a reakcióelegy térfogatát 3000 ml-re töltjük fel. A reakcióelegyet 37 °C-os termosztátba helyezzük. Feloldunk 500 ml desztillált vízben 164 g ATP-t, pH-ját 1 n NaOH-val 7-re állítjuk be, és ezt az ATP-oldatot 5 részletben 1 órás időtartamokban a fenti reakcióelegyhez adagoljuk. A reakcióelegy pH-ját 3—4 óránként ellenőrizzük és szükség szerint 10 n NaOH-val 7-re állítjuk. A reakcióelegyben keletkezett NADP mennyiségét enzimatikus redukció útján 8, 20, 24, 28 óra múlva ellenőrizzük ós amikor konverzió változást már nem észlelünk, a reakcióelegyet lehűtjük és lefagyasztjuk. Fagyasztott állepotban 1—4 hétig mélyhűtőben tárolható jelentős anyagveszteség nélkül. A reakcióelegyben keletkezett termékeket (NADP, ADP, ATP, NAD) ioncserés kromatográfiával választjuk el. Az ioncserét Dowex IX anioncserélo gyantán végezzük. A semlegesre mosott formiát ciklusban levő gyantára öntjük a reakcióelegyet, desztillált vizes mosással eltávolítjuk a NAD-kinázt, majd az eluálást 0,1 mólos nátriumformiát és 0,1 mólos hangyasav puff érrel végezzük. Az egyes frakciók NADP tartalmát enzimatikus redukcióval mérjük (frakciótérfogat 5 1). Csak azokat a frakciókat gyűjtjük, amelyeknek a NADP tartalma meghaladja a 260 nm-nél mért extinkcióból számított NADP tartalom 80%-át. Az így nyert frakciókat összegyűjtjük (80—100 liter) és vákuumban gyorsbepárlón eredeti térfogatának tizedére bepároljuk, az oldat pH-ját cc perklórsavval pH = 2-reállítjuk, szűrjük és 4-szeres térfogatú 0 °C-os acetonba öntve kicsapjuk. A csapadékot hidegen hűthető centrifugában kicentrifugáljuk, 1500 ml desztillált vízben feloldjuk, az oldat pH-ját cc. perklórsavval 2-re állítjuk. Tükrösre szűrés után a tiszta NADP-t tartalmazó oldatot 10-szeres térfogatú 0 °C-os abs alkoholban kicsapjuk, a csapadókot leszűrjük és többszöri abs. alkohollal való mosás után foszforpentoxid felett szobahőmérsékleten vákuumszárító szekrényben súlyállandóságig szárítjuk. Kitermelés: 86 g NADP-Na-só Összetétele: C21 H 28 N 7 0 17 P 3 Na 1 Molekulasúly: 766,5 Tisztaság: 260 nm-nél mért extinkció alapján a fenti molekulasúlyra vonatkoztatva 85%. 2. példa Mindenben azonos az 1. példa szerinti eljárással, de az extraktumhoz 50 liter 0,3 mólos pH = 7,5 glicilglicin puffert adunk, amelyben összesen 15 g NAD van feloldva, és a hőkezelést 62,5 °C-on 250 percen keresztül végezzük. A hozam 26 550 E NAD-kináz, amelynek felhasználásával az 1. példa szerint eljárva 67%-os konverziót érünk el. 3. példa Mindenben az 1. példában leírttal azonos módon járunk el, de a hőkezelés után a centrifugálással nyert tiszta felülúszóhoz 9,7 kg ammóniumszulfátot (0,4-es telítés) adunk, a kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk, majd a tiszta felülúszóhoz további 3,15 kg ammóniuniszulfátot adagolunk (0,5-os telítés). Az így nyert fehérjecsapa-5 dékot az 1. példa szerint dolgozzuk fel tovább. Hozam: 19 000 E NAD-kináz, amely azonban az 1. példa szerinti felhasználásnál 24 óra alatt 88,5%os konverziót eredményez. 10 4. példa Mindenben azonos az 1. példa szerinti eljárással, de a sótalanítást Molselect G—25-ös oszlopon végezzük. Hozam: 31 500 E NAD-kináz, és az NADP előállítását az 1. példa szerint végezve a kon-15 verzió 70%. 5. példa Mindenben az 1. példában leírtakkal azonos módon járunk el, de a gélfiltrálással történő sóta-20 lanítás helyett dialízissel végezzük a sómentesítést oly módon, hogy az ammóniumszulfátos telítésnél (0,33—0,55) kapott fehérjecsapadékot 1 liter 0,05 mólos pH = 7,5 0,02 s% NAD-ot tartalmazó glicilglicin pufferben feloldjuk, és 0,05 mólos 25 pH = 7,5 glicilglicin pufferrel szemben szulfátmentesre dializáljuk, a dializált oldathoz újabb 0,02 s% NAD-ot adunk, és az oldatot liofilizáljuk. Ily módon 25 g liofilizált barna port kapunk, amelynek specifikus aktivitása 1 E/mg. A felhasz-30 nálásnál az 1. példa szerint eljárva a konverzió 72%. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők : a) Már az extraktum feldolgozásának első lépé-35 sénél nagyfokú tisztítás érhető el, a további tisztítás így lényegesen leegyszerűsödik és a veszteségek nagy mértékben csökkennek. b) Mivel az enzim aktivitásának mérését zavaró ATP-áz már az első feldolgozási lépésnél inaktiváló-40 dik, így az eljárás során végig mérni lehet a bekövetkező veszteségeket, miáltal a gyártás menete ellenőrizhetővé válik. c) Szükségtelenné válik az ipari méretekben nagy bizonytalanságot és jelentős veszteségeket 45 okozó specifikus adszorpciós lépés, ugyanakkor a kapott végtermék aktívabb. d) Az eljárás üzemileg is reprodukálható. e) A találmány szerinti eljárás a 157 298 lsz. magyar szabadalom szerinti eljáráshoz képest 50 mintegy háromszoros hozamnövekedést eredményez. f) A találmány szerint előállított enzimkészítmény felhasználásával a NAD-foszforilálás reakcióideje 72 óráról 28 órára csökken. 55 g) A találmány szerint előállított enzimkészítmény ipari kivitelezésű felhasználásánál átlagosan 30%-kal jobb konverzió érhető el, mint a 157 298 lsz. magyar szabadalom szerinti enzimkészítmény ipari alkalmazásánál. 60 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid ipari 65 méretű foszforilálására alkalmas kináz enzimkészít-3
