165727. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peroxidáz enzim előállítására

165727 3 4 d) a hosszadalmas dialízis nagy mértékben megnöveli a fehérjeoldat térfogatát, és ezért az oldószeres frakcionált kicsapás sok oldószert igényel. e) A fentebbi hátrányok folytán a peroxidázkihozatal igen alacsony: 100 kg tormagyökérből kb. 10—12 g nyers termék (RZ: 0,3; aktivitás: 50—100 egység) kapható. P. M. Cooper és J. F. Largier a Process Biochemistry című folyóiratban [3 (8), 22 (1968)] eljárást ismertetnek torma-peroxidáz üzemi előállítására, amely abban áll, hogy a tormagyökeret homogenizálás után ammóniumszulfát-oldattal extrahálják, az extraktumot szűrik, majd a szüredékből a peroxidaz enzimet ammóniumszulfát hozzáadásával kicsapják, a csapadékot szűrik, vízben oldják, és ammóniumszulfátos kisózással ismét frakcionálják. Az így kapott enzimcsapadékot sómentesítés céljából kimerítően dializálják, majd frakcionáltan kromatografalják dietilaminoetil-cellulóz oszlopon. Az oszlopról eluált aktív frakciókat ammóniumszulfáttal ismét kicsapják, sómentesre dializálják, és fagyasztva szárítják. Ennek az eljárásnak hátránya, hogy rendkívül hosszadalmas, és az ammóniumszulfátos eljárás fentebb ismertetett valamennyi hátrányát is mutatja. A Chem. Abstr. 69. évfolyamának 64 747 f jelű referátuma szovjet szerzők laboratóriumi eljárását ismerteti, amely abban áll, hogy felszeletelt tormagyökeret öt napon át dializáinak, a dializáit szeleteket sajtolják, 0,4%-os oxálsav-oldattal kezelik, majd ismét sajtolják. A sajtolt gyökérmaradékot finomra őrlik, és 3 napon át vízzel kezelik, majd ismét sajtolják. Az extraktum pH-ját 7-re állítják be, majd azonos térfogatú etanolt adnak hozzá. Szűrés után a szűredéket vákuumban betöményítik, az enzimet etanol hozzáadásával kicsapják, vízben oldják, majd gél-elektroforézissel tisztítják. Az elektroforézis megismétlése után jutnak a tisztított termékhez. Ez az eljárás is rendkívül hoszszadalmas, és ezen túlmenően igen költséges is, mert speciális sajtoló berendezést, valamint a dializáló berendezésen kívül elektroforézis-készüléket is igényel. A találmány célja a fenti hátrányok kiküszöbölésével olyan eljárás biztosítása, amely mind üzemi, mind laboratóriumi körülmények között jól reprodukálhatóan és jó kitermeléssel teszi lehetővé peroxidaz előállítását. A találmány további célja, hogy az idényjellegű kereskedelmi termékként kapható és drága tormagyökér és feketeretek helyett olcsóbban és könnyebben hozzáférhető nyersanyagok, vagy akár hulladékanyagok felhasználására is alkalmas eljárást biztosítson. A találmány alapja felismerés, hogy az ismert eljárásokban a szennyezések eltávolítása céljából alkalmazott ammóniumszulfátos frakcionált kisózás elhagyható, mert e szennyezések egyszerűen eltávolíthatók vízzel szemben végzett dialízissel. Ily módon lehetővé válik olyan tisztaságú dializátum előállítása, amelyből külön tisztítási műveletek nélkül megfelelő minőségű termék nyerhető. A találmány további alapja az a felismerés, hogy az ammóniumszulfátos kisózás kiküszöbölése a technológiából lehetővé teszi az enzim tartalmú kivonat besűrítését, és mind a nedves, mind a szárított tormapornak kiindulási anyagként való felhasználását. 5 A találmány még további alapja az a felismerés, hogy a növényi gyökerek külső, raktározó sejtjeiben lényegesen magasabb a peroxidáztartalom, mint a középponti szállító edénynyalábokban. Ez azt eredményezi, hogy a kiindulási anyagként 10 igen előnyösen felhasználható a tormagyökér külsejéről lehántott és eddig hulladékként kezelt héjréteg, valamint a tormafehérítő, ill. -mosó folyadék is. 15 Fentiek alapján a találmány tárgya eljárás peroxidaz enzim előállítására, amely abban áll, hogy tormagyökér felületéről lehántott gélréteget vagy szárított vagy nedves tormaport önmagában ismert módon vízzel extrahálunk, a kapott 20 extraktumot vagy élelmiszeripari tormafehérítő, illetve -mosó folyadékot 60 °C alatti, előnyösen 40—45 °C hőmérsékleten vákuumban eredeti térfogatának legfeljebb 1/15-ére betöményítjük, az így kapott sűrítményből vízzel szemben végzett 25 közvetlen dialízissel peroxidaz enzimoldatot állítunk elő, és adott esetben a kapott dializátumot 60 °C alatti hőmérsékleten vákuumban térfogatának legfeljebb 1/20-ára töményítjük, majd a kapott oldatból a peroxidázt önmagában ismert 30 módon, frakcionáltan kicsapjuk. Adott esetben az így kapott peroxidázt legalább 20 napon át öregített kalcium-foszfát gélen végzett adszorpcióval tisztítjuk. Ezt a Ca-foszfát gélt az S. P. Colowick és N. O. Kaplan „Methods in 35 Enzymology" című, fentebb idézett könyve II. kötetének 805. oldalán található, 24 jelű lábjegyzet szerinti módon állítottuk elő. A gél öregítése abban állt, hogy azt két hónapon keresztül szobahőmérsékleten állni hagytuk. 40 A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők : a) Lehetővé teszi peroxidaz előállítását olcsó és könnyen hozzáférhető nyersanyagokból, vala-45 mint az eddig hulladékanyagként kezelt élelmiszeripari tormafehérítő és -mosó folyadékokból és tormahántolási hulladékból. b) Kiküszöböli a nagy anyagigényű ammóniumszulfátos kisózást és így feleslegessé teszi az ammó-50 niumszulfát dialízises eltávolítását. c) A bepárlások lehetővététele lényegesen kisebb térfogatok mozgatását és dialízisét teszi csak szükségessé. Ennek megfelelően az oldószeres frakcionált kicsapásnak is kisebb az anyagigénye. 55 d) Egyszerűbb és gyorsabb az eddigi eljárásoknál, és azonos mennyiségű nyersanyagból mintegy 10—20-szoros kitermelést (100 kg tormagyökérből 90—220 g nyers terméket) eredményez. e) A csökkent térfogatok és anyagfelhasználás 60 folytán az eljárás lehetővé teszi peroxidaz ipari méretű előállítását is. f) A fajlagos anyag- és munkaköltség jelentős csökkenését teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az 65 alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 2