165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására
5 165725 6 molekulán belül. Az immunológiai keresztreakció pl. az alábbiak szerint határozható meg: Nyulak egy csoportjában az antitestek -képződése előidézhető. A enzim (A antigén) tartalmú ismételt intramuszkuláris injekcióval. Ezeknek az állatoknak a széruma anti-A-antitesteket tartalmaz, amelyek, ha az A enzimmel (A antigénnel) érintkezésbe kerülnek, kicsapódó komplexet képeznek. Nyulak másik csoportját immúnissá tettük B enzim (B antigén) ellen. Ezeknek az állatoknak a széruma anti-B-antitesteket tartalmaz, amelyek a B enzimmel (B antigénnel) kicsapódó komplexet képeznek. Ha precipitin reakció nem jön létre anti-A és B és anti-B A között, nincs A és B között keresztreakció. Precipitin reakciók lefolytathatók úgynevezett fél diffúziós próbában, 1%-os agaróz gélen, pH = 8-nál. A vizsgálat kivitelezéséhez szükséges anyagok a kereskedelemben kaphatók (ld. pl. Miles-Seravac Ltd. Lausanne, Svájc). Példaként nyulakat immúnissá tettünk Bothrops atrox méreg trombinszerű enzime ellen. Ezeknek a vizsgált állatoknak a véréből olyan szérumot kaptunk, amely nemcsak Bothrops atrox méreg trombinszerű enzimjét semlegesítette, hanem Crotalus durissus terrificus trombinszerű enzimjét is. így immunológiai keresztreakció játszódott le a Bothrops atrox méreg trombinszerű enzimje és a Crotalus durissus terrificum méreg trombinszerű enzimje között. Másrészről, az az antiszérum, amely aktív a Bothrops atrox méreg trombinszerű enzimjével szemben, semlegesítette az Agkistrodon rhodostoma méreg trombinszerű enzimjét és az az antiszérum, amely aktív Agkistrodon rhodostoma méreg trombinszerű enzimjével szemben, nem semlegesíti a Bothrops atrox méreg trombinszerű enzimjét. Következésképpen a Bothrops atrox és Agkistrodon rhodostoma mérgek trombinszerű enzimjei között immunológiai keresztreakció nem játszódott le. A Bothrops atrox méreg beszerzési lehetőségei a következők: Közép-Amerikában (Costarica) Bothrops asper méreg; Észak-Brazíliában Bothrops marajuensis méreg; Közép- és Dél-Brazíliában pedig Bothrops moojeni méreg néven hozzák forgalomba. A következőkben részletesebben ismertetjük a találmány szerinti eljárást az említett tulajdonságokkal rendelkező enzimkészítmény előállítására. Fagyasztva-szárított (liofilizált) kígyómérget, például a Bothrops atrox mérgét kb. 4,5—7-es pH-nfiziológiás konyhasóoldatban oldjuk. Centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk a fel nem oldódott anyagot. A tiszta méreg oldat pH-értékét ásványi sav, például sósav vagy kénsav vagy szerves sav, például ecetsav hozzáadásával gyengén savanyúra (például kb. 3—4-re állítjuk be, majd keverés közben melegítjük az oldatot, úgyhogy a ballaszt fehérjék hatóanyagveszteség nélkül váljanak ki. E ballaszt anyagok kiválásának mértéke a melegítés időtartamának, az alkalmazott hőmérsékletnek és az oldat pH-jának a függvénye. pH = 3 esetében már néhány perces melegítés, így például 30 °C-on 10 perces melegítés is elegendő. pH = 3,5-nél a melegítési idő 30 °C-on alkalmasan 1 órára vagy 40 °C-on 30 percre hoszszabbodik meg. pH = 4-nél a melegítési idő kb. 2 órára hosszabbodhat meg, a hőmérséklet pedig 5 kb. 50 °C-ra emelkedhet. A kivált fehérjéket centrifugálással választjuk el. A szűrlet kémhatását pH = kb. 4,5—7-re, előnyösen kb. 6,5-re állítjuk be, és az oldatot frakcionált kisózásnak vetjük alá előbb a ballaszt-10 anyagok frakciójának eltávolítására, majd a hatóanyag frakciójának kicsapására. A frakcionált kicsapást ásványi savak ammónium-, alkáli fémvagy alkáli földfémsóival, így például nátriumkloriddal vagy szulfáttal, magnéziumkloriddal 15 vagy szulfáttal és ammóniumklórddal vagy szulszulfáttal végezhetjük. Ha ammóniumszulfátot pH = 6,5-nél alkalmazunk, a ballaszt frakció 40% telítettségnél, a hatóanyagfrakció pedig 55%os telítettségnél válik ki, mindkettő 20 °C hőmér-20 sékleten. Amennyiben más sókat, pH-értékeket és kicsapási hőmérsékleteket alkalmazunk, a fentiektől eltérő telítettségekre van szükség. Az aktív frakciókat centrifugálással elválasztjuk az anyalúgtól és feloldjuk desztillált vízben. 25 Az oldat pH-ját kb. 4—6-ra, előnyösen 5,0-ra állítjuk be. 7 súly% fenol vagy ennek megfelelő mennyiségű fenolszármazék hozzáadásával komplex alakjában kicsapjuk a hatóanyagot. A célnak megfelelő fenolszármazékok a fenolkarbonsavak, 30 így például a szalicilsav, az alkilfenolok, például az o-, m- vagy p-krezol, a halogénezett fenolok, például az o-, m- vagy p-klórfenol, a halogénezett vagy alkilezett fenolkarbonsavak és a klórfenolsavak vagy a fenolkarbonsavak vagy ezek szár-35 mazékainak sói, például a nátriumszalicilat ós a krezolkarbonsavak nátriumsói. A szabad fenolcsoportokkal rendelkező fenol-formaldehid gyanták, például az Amberlite XE 97, ugyancsak alkalmazhatók. A kicsapószer szükséges mennyisége általá-40 ban a megfelelő származék oldhatósági határának vagy a savak esetében a megfelelő szabad sav oldhatósági határának felel meg. A hatóanyag ily módon előállított oldhatatlan komplexét centrifugálással választjuk el és az a) vagy b) változatok 45 bármelyike szerint bontjuk meg. Az a) változat szerint eljárva, az elválasztott komplexet annak megbontása és a fenol vagy a fenolszármazék oldatbevitele céljából több ízben mossuk ecetsav poláros oldószerben készített 0,1— 50 0,5%-os oldatával. E műveletnél a szabaddá tett hatóanyag oldhatatlan maradék alakjában marad vissza. Alkalmas poláros oldószerek például a CJL—C4 lánchosszúságú alkanolok, az R x — CO—R2 általános képletű dialkilketonok, amely általános 55 képletben az Rx és R 2 például C x —C 4 lánchosszúságú alkilcsoportokat jelentenek, valamint az Rx —O—R 2 általános képletű diaikiléterek, ahol az Rx és R 2 például C 2 —C 3 lánchosszúságú alkilcsoportokat képviselnek. 60 A b) változat szerint eljárva a hatóanyagból ós fenolból vagy fenolszármazékból álló komplexet kb. 7,5—8,5-ös, előnyösen 8-as pH-n vízben oldjuk. A pH értékét alkálifémhidroxiddal, alkálifémacetáttal, alkálifémcitráttal, alkálifémkarbo-65 náttal vagy bikarbonáttal, di- vagy trialkálifém-3
