165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására

7 165725 8 foszfáttal vagy más bázisos kiegyenlítőszerrel vagy ammóniumhidroxiddal vagy ammóniával állíthatjuk be. Az oldatot nitrogén nyomás alatt olyan szemnyílású ultraszűrőn szűrjük át, amely a hatóanyagot, enzimkészítmónyt a szűrőn visszatartja, míg a fenol vagy a fenolszármazék oldott állapotban áthalad a szűrőn. Alkalmas szűrők az UM—05, UM—2, UM—10 és PM—10 típusú „Diaf—10"-szűrők (a ,,Diaflo"-szűrők az AMICON, Oosterhout N. B. Hollandia cég által forgalomba hozott ultraszűrők, például szintetikus polimerekből készült membránok). A szűrőn viszszatartott hatóanyagot az esetleg még visszamaradt fenol vagy fenolszármazók eltávolítása céljából több adag desztillált vízzel vagy alkalmas tartósítószer oldatával mossuk, és egyidejűleg töményítjük. A fenoltól vagy fenolszármazéktól megszabadított aktív enzimkészítmények aktivitása kb. 10—15 NIH-trombin egység per 1 mg szárazanyag (I tisztasági fok). Az így kapott termék még ennek ellenére nem megfelelő, minthogy immunelektroforézissel még mindig három precipitin vonal, akrilamid elektroforézissel négy fehérje-zóna jelenik meg, színe pedig sárga. Sőt, az I tisztasági fokú enzimkészítmény tromboplasztin aktivitást is mutat. Az I tisztasági fokú enzimkészítményt további tisztítás céljából feloldhatjuk trisz(hidroximetil)-aminometán-foszfát kiegyenlítő oldatban (pH = 6,0, 0,02 mólos). Ily módon 5%-os oldatot kapunk, amelyet előzetesen P04- alakra hozott és TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (pH = 6,0, 0,02 mólos) kiegyensúlyozott DEAE-„Sephadex A—50" oszlopon kromatografálunk (DEAE = dietilaminoetil; „Sephadex" a PHARMACIA, Uppsala, Svédország cég által forgalomba hozott polidextrán termékek védjegye). A kromatográfiát oly módon hajtjuk végre, hogy az enzimkészítmény oldatát az oszlopra öntjük, az oszlopot annak négyszeres térfogatát kitevő mennyiségű TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (pH = 6,0, 0,02 mólos) mosva eltávolítjuk a ballasztanyagokat, majd az oszlop térfogatára vonatkoztatva kétszeres térfogatú TRIS-foszfát kiegyenlítő oldattal (pH = 6,0, 0,04 mólos) az enzimkészítményt az oszlopról leoldjuk. A sókat az aktív eluátumból ultraszűréssel távolítjuk el. A szűrlet fagyasztva-szárításával II. tisztasági fokú enzimkészítményt kapunk, amely 100—200 NIH-trombin egység/mg fehérjetartalom aktivitásnak felel meg. Az immunelektroforézis most egyetlen precipitin-vonalat mutat, míg az akrilamin elektroforetikus képben két zónát észlelhetünk. Az enzimkészítményt kristályos alakban kaphatjuk meg, ha az ultraszűrés során kapott sómentes koncentrátumot -f-2 °C hőmérsékleten 48 óráig állni hagyjuk, a kivált kristályokat hűtés közben centrifugálással elválasztjuk, majd jéggel hűtött desztillált vízzel mossuk. Ily módon kis hozammal téglalap alakú, lemezkéket kapunk, amelyekből azután vákuumban végrehajtott szárításnál gyorsan, levegőn végzett szárításnál fokozatosai, amorf részecskék keletkeznek. Ha az ilyen kristályszuszpenziókat szárítjuk, kb. 200 NIH-trombin egység/mg fehérje tartalmat meghaladó aktivitásii (III. tisztasági fokú) enzimkészítményeket kapunk. A II. tisztasági fokú enzimkészítmény a papír-5 elektroferogram, membránelektroferogram, gélkromatogram, ioncsere kromatogram és az Ouchterlony-féle immundiffuzogram szerint homogén. Poliakrilamid gélben végrehajtott elektroforézis révén viszont farmakológiailag hatástalan polipep-10 tid frakció választható el az aktív enzimfrakciótól. A hatástalan összetevőt az aktív enzimfrakciótól a II. tisztasági fokú enzimkészítmény gélkromatográfiája utján is elválaszthatjuk. Ennél a módszernél futtatószerként alifás karbonsav vízzel vagy 15 vizes kiegyenlítő (puffer) oldat vízzel elegyedő szerves oldószerrel alkotott elegyét alkalmazzuk. A gélkromatográfiához hidrofób és hidrofil géleket egyaránt használhatunk. Hidrofil gélek például a polidextrán gélek, mint a „Sephadex" 20 (a Pharmacia, Uppsala, Svédország cég terméke), a poliakrilamid gélek, mint a ,,Bio-Gel" (készíti a Bi-Rad Laboratories, Richmond, California) és az agaróz vagy agar gélek, mint a „Sepharose" (a Pharmacia, Uppsala, Svédország cég terméke). 25 A gélkromatográfiát alkalmas módon állandó hidrogénion koncentráció mellett, például kb. 2 és 9, előnyösen 2 és 6 közötti pH-n hajtjuk végre. Alkalmas karbonsavak például a vízzel elegyedő nyílt láncú, egyenes vagy elágazó és 1—4 szén-30 atomot tartalmazó lánccal rendelkező monokarbonsavak. Pufferként víz és szerves oldószerek elegyeiben oldódó szokványos pufferek, például szervetlen bázisok, így az alkáli fémek vagy az ammónium vagy szerves bázisok, így a piridin vagy a 35 trisz(hidroximetil)-aminometán formiátjai, acetátjai, foszfátjai, citrátjai és karbonátjai alkalmazhatók. A legalkalmasabbak az UV-sugárzást el nem nyelő és a vákuumban illó pufferek, mint az ammóniumformiát vagy az ammóniumacetát, ami 40 lehetővé teszi, hogy a kromatográfiát az eluátumok UV-tartományú denzitometriás értékelésével kísérhessük, és hogy az eulátumokat fagyasztvaszárítással koncentrálhassuk. Az alifás karbonsavakat 5—95 tf% töménységű vizes oldataikban 45 használhatjuk. Ha a kromatográfiához hidrofil géleket használunk, a karbonsavat alkalmasan 5—50 tf% töménységben alkalmazzuk. Ha vizes kiegyenlítő oldatokat használunk, ahhoz vízzel elegyedő szerves oldószert adunk, 5—95 tf% kon-50 centrációban. Ha hidrofil géleket használunk, az oldószer koncentráció célszerűen 10—50 tf%. Megfelelő vízzel elegyedő oldószerek például az egyenes vagy elágazó láncú és molekuláikban 1—5 szénatomot tartalmazó alkanolok, a ketonok, 55 mint az aceton, a dietilketon vagy a metiletilketon, az alkilaminók, mint a mono-, di- vagy trimetil-, etil- vagy propilamin, az uretánok, mint az etiluretánok. Tekintettel arra, hogy az aluátumokat előnyösen fagyasztvaszárítással töményít-60 jük, ajánlatos vákuumban illó ós olyan oldószereket alkalmazni, amelyek az oldat fagyáspontját lényeges mértékben nem szállítják le. Alkalmas oldószerek például a terc-butilalkohol és a ciklohexanol. 65 A fentiekben ismertetett módon gélkromatográ-4