165725. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új enzimkészítmény előállítására
165725 3 4 végzett meghatározás szerint egy vagy több, kb. 18 000 és 55 000 közötti molekulasúlyú polipeptidet tartalmaz; c) a készítmény a fehérjetartalomra vonatkoztatva kb. 2—10 súly% szénhidrátot (semleges cukor) tartalmaz; d) desztillált vízben [alig oldódható azonban fiziológiás konyhasó oldatban; e) fenollal és fenolszármazékokkal vízben alig vagy egyáltalában nem oldható komplexeket alkot; f) a fibrinogen alvadását idézi elő azáltal, hogy a fibrinogénből a B fibrinopeptidek felszabadítása nélkül szelektív módon távolítja el az A fibrinopeptideket; g) trombinszerű hatása kb. 30—450 NIH-trimbin egység per mg fehérjetartalomnak felel meg (1 egység = az az enzim mennyiség, amely az emberi fibrinogénre alkalmazva a trombin 1 NIH-egységével megegyező alvadási időt ad; NIH = National Institute of Health, USA); h) bontja a tozilargininmetilésztert és a zselatint, nem bontja azonban a lizinmetilésztert, fenil-alaninetilésztert, N-acetilmetionint, N-acetiltirozint, leucilglicint és a kazeint; i) a készítményt heparin, heparinoidok, hirudin, antitrombinok és a Kunitz-féle polivalens peptidáz inhibitor (v.o. J. Gen. Physiol. 19, 991—1007, 1936) nem gátolják; j) a készítményt kb. 5 mg/cm3 enzim koncentrációban 2,5X 10-3 mólos diizopropilfluorofoszfát pH = 8-nál 2 órán belül alvadásgátló és eszteráz hatásának mintegy 95%-a mértékéig gátolja; k) a készítmény aktivitását kompetitív módon gátolja a tozilargininmetilészter ós teljesen bénítja az antibothrops szérumban jelenlevő antitest; 1) nem kötődik a fibrinhez és ezért a fibrin nem inaktiválja; m) biológiai féléletideje lényegesen hosszabb a heparinénál; n) olyan fibrinszármazék keletkezéséhez vezet, amely a fibrinogen feleslegével nem polimerizálódó fibrin-fibrinogén komplex képződése közben reagál; o) a fibrinogénre olyan fibrin keletkezése közben hat, amelynek fizikai-kémiai tulajdonságai különböznek a trcmbin által létrehozott fibrinéitól, amennyiben fibrinbontó emzinek, például a plazmin, a keletkezett fibrint meg aktivált XIII-as faktor és kalcium-ionok jelenlétében is gyorsan hidrolizálják, továbbá 5 mólos vizes karbamid oldatban oldható; végül p) in vivo vérzéses és trombo-embóliás mellékhatások nélkül idézi elő a fibrinogen eltűnését a vérből és másodlagos fibrinolízist. A fenti tulajdonságokkal rendelkező enzimkészítmény előállítására kidolgozott találmány szerinti eljárást jellemzi, hogy — a Bothrops atrox mérgéből vagy bármely más, a Bothrops atrox mérgével immunológiai keresztreakciót adó kígyóméregből kb. 4,5—7 pH-jú izotóniás vizes oldatot készítünk; a) az izotóniás oldatból frakcionált kisózással előbb eltávolítjuk a ballaszt anyagokat, majd kicsapjuk az enzimanyagot tartalmazó frakciót, e frakciót desztillált vízben feloldjuk, az oldat pH-ját kb. 3 és 4 közötti értékre állítjuk be, az oldatot néhány perctől a kb. 2 óráig terjedő időn át kb. 30—50 °C hőmérsékleten melegítjük, a kivált fehérjéket elválasztjuk, és a visszamaradó oldat pH-ját kb. 4—6-ra állítjuk be; 5 vagy b) az izotóniás oldat pH-ját kb. 3—4-re állítjuk be, az oldatot néhány perctől a kb. 2 óráig terjedő időn át kb. 30—50 °C hőmérsékleten melegítjük, a kivált fehérjéket elválasztjuk, a visszalő maradó oldat pH-ját kb. 4,5 és 7 közötti értékre állítjuk be, frakcionált kisózással előbb eltávolítjuk a ballasztanyagokat, majd kicsapjuk az enzimanyagot tartalmazó frakciót, e frakciót desztillált vízben feloldjuk, és az oldat pH-ját kb. 4 és 6 15 közötti értékre állítjuk be; az a) vagy b) változatok bármelyikével előállított oldatból fenol vagy fenolszármazék adagolásával oldhatatlan komplex alakjában kicsapjuk az enzimanyagot, és 20 c) a komplexet poláros szerves oldószerben híg ecetsavval megbontjuk, és a felszabadult kiváló enzimanyagot elválasztjuk; vagy d) a komplexet vizes közegben kb. 7,5—8,5 25 pH-n bázissal kezeljük, a felszabaduló enzimanyagot ultraszűréssel, dialízissel vagy gélszűréssel elválasztjuk, és az így kapott enzimanyagot tovább tisztítjuk. A találmány szerinti eljáráshoz kiindulási anyag-30 ként alkalmazott méreg célszerűen a Bothrops atrox kígyó mérge. Az irodalom e kígyó más elnevezéseit és meghatározásait is ismerteti, így például szerepel a Coluber atrox LINNAEUS (Sys. Nat. Ed. 10, 1:222, 1758), Botrops atrox 35 LINNAEUS (Duméril, Bibron et Duméril, Erpét. gén. 7:1507, 1854), Lachesis lanceolatus BOULENGER (Cat. Snak. Brit. Mus., 3:535, 1896), Lachesis atrox LINNAEUS (Boulenger, Cat. Snak. Brit. Mus., 3:537, 1896), Bothrops atrox 40 LINNAEUS (J. A. Peters, Bull. Mus. comp. Zool,. Cambridge, Mass., 122:509, 1960) és Bothrops mojeni HOGE (A. R. Hoge, Mem. Inst. Butantan, 32:126, 1965). Más Bothrops fajok, így például a Bothrops jararrca mérge is használható. Általános-45 ságban bármely más olyan kígyó mérge is használható, amely a Bothrops atrox mérgével immunológiai keresztreakciót ad. Az „immunológiai keresztreakció" kifejezés meghatározása és magyarázata megtalálható például E. A. Kabát 50 és Mayers: Experimental Immuno chemistry c. könyvében, második kiadás, 1971. 405—442. old. Az immunológiai keresztreakció a következőképpen határozható meg: Míg az antitestek általában csak az immunizációhoz alkalmazott anti-55 génnel (a homológ antigénnel) reagálnak, bizonyos kivételes reakciók, melyeket keresztreakcióknak nevezünk, ugyancsak megfigyelhetők. Ezek a reakciók más vegyületekkel következnek be, mint a homológ antigének. Kémiai tanulmá-60 nyokból nyivánvalóvá vált, hogy a keresztreakciók az antigének közötti szerkezeti hasonlóság következtében lépnek fel. A „keresztreakció" fogalom különböző, egyes antigének közötti szerológiai rokonságra vonatkozik, amelyek feltételezhetően 65 hasonló szerkezetű csoportokkal rendelkeznek a 2
