165651. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására G-penicillin-enzimatikus lebontása útján
3 165651 4 e) A 6-aminopenicillánsav kitermelés üzemben a penicillinaciláznak a- fermentációs közegben való változó mennyiségű képződésétől függ. f) A 6-aminopenicillánsavat tartalmazó elegy feldolgozása során a baktériumsejtek teljes elválasztásához még egy elválasztási műveletre van szükség, ez kitermelés veszteséget von maga után. A proteinszerű szennyezések eltávolítására, amelyek allergiás reakciókat válthatnak ki, további tisztítási lépésekre van szükség (1169 696, 1078 847 és 1 114 311 sz. brit szabadalmi leírás). g) Az eljárás kftermslés«: 70-75%. A találmány szerinti eljárás segítségével az összes fenti hátrányt kiküszöböljük, ha a baktérium szuszpenzió helyett olyan penicillinacilázt alkalmazunk, amely kovalens kötéssel kapcsolódik egy akrilamidból, N,N'-metilén-bisz-akrilamidból és maleinsavanhidridből álló keverék-polimerizátumhoz és vízben oldhatatlan. Az 1917 0557 és 1907 365 számú nyilvánosságra hozott NSZK-beli szabadalmi bejelentésekből ismertek más olyan kísérletek, amelyek szerint 6-aminopenicillánsavat hordozóhoz kötött penicillinacilázzal állítanak elő enzimatikus lebontás útján, ezeket az eljárásokat azonban nem lehetett ipari méretben megvalósítani. Penicillinek hordozóhoz kötött penicillinacilázzal végzett hasítását a találmány szerinti módon egyszerűen elvégezhetjük és az eljárás nagyüzemben is megvalósítható. Az oldhatatlan enzimet 75—150 000 egység/ml töménységű penicillinoldatban például G-penicillin-kálium oldatban szuszpendáljuk. Az enzimatikus Jebontást konstans pH-értékben, 6—8 pH-tartományban valósítjuk meg. A lehasított fenüecetsav semlegesítésére vizes alkalikus oldatokat, például kálium- vagy nátriumhidroxid-oldatot vagy szerves aminokat, előnyösen trietilarránt alkalmazunk. Trietilamin alkalmazásakor például az oldhatatlan enzim aktivitása többszöri alkalmazása után is azonos marad. A találmány szerinti enzimatikus lebontást előnyösen 7,8 pH-értéken végezzük. 8,0 feletti pH-értéken a penicillin vagy a 6-aminopenicillánsav a /3-laktámgyűrű felnyílása közben inaktiválódhat. Alacsonyabb pH-értékek esetén az egyensúly a penicillin kiindulási anyag felé tolódik el, így a lebontás nem lesz teljes. Előnyösen 7,8 pH-értéken dolgozunk. Előnyösen úgy járunk el, hogy a lebontást alacsony pH-értéken kezdjük és a reakció vége felé lassan 7,8-re emeljük. A reakciósebesség a hordozóhoz kötött enzim adagolásától függ. így például, ha 100000 egység/ml G-penicillin-kálium koncentrációjú elegyből indulunk ki, a kiindulási anyag 7,8 pH-értéken és 38 C°-on 12 óra alatt teljesen 6-aminopenicillánsawá és fenilecetsawá hidrolizálódik, ha egy egység penicillinacilázra 105 egység G-penicillint adagolunk. (1 enzimegység olyan aktivitásnak felel meg, amely 1 jumól G-penicillint 37 C°-on 1 perc alatt hidrolizál 6-aminopenicillánsawá és fenilecetsawá.) Ha egy egység penicillinacilázra számítva 5 x 104 egység G-penicillint adagolunk, a teljes lebontás 6 órán át tart. Nagyobb enzim mennyiség beadagolása esetén rövidebb reakcióidőre van szükség. Ugyanígy hosszabb ideig kell végeznünk a lebontást, ha kevesebb enzimet alkalmazunk. Ha azonban a 5 lebontás ideje több, mint 20 óra, a penicillin és/vagy 6-aminopenicillánsav inaktiválódása következtében csökken a kitermelés. Az enzimatikus lebontást előnyösen 38 C° hőmérsékleten végezzük. Alacsonyabb hőmérsék-10 léten csökken az enzim aktivitása. Ha a hasítást például 25 C°-on végezzük, kétszer annyi enzimet kell beadagolni, mint 38 C° esetén, ha ugyanolyan reakcióidőt akarunk elérni. Az oldhatatlan, hordozóhoz kötött penicillin-15 aciláz aktivitása nagyobb szubsztrát-koncentrációjú oldatokban szemmel láthatóan csökken. 75 000 egyésg/ml G-penicillin koncentrációjú oldat lebontása 12 órán keresztül tart és 150000 egység/ml koncentráció esetén a lebontás ideje 15 20 óra, ha csak a koncentrációt változtatjuk, azonban nem változtatunk az enzim és a G-penicillin arányán. Előnyösen 75 000-100 000 egység/ml G-penicillin koncentrációjú oldatokat alkalmazunk. 25 A 6-aminopenicillánsavat könnyen elkülöníthetjük, ha a találmány szerinti enzimkészítményt alkalmazzuk. A hordozóhoz kötött penicillinaciláz mennyisége 0,005 súly% esetén olyan csekély, hogy a hordozóra alig adszor-30 beáiható 6-aminopenicillánsav. A hordozóhoz kötött penicillinacilázt a lebontás után centrifugálással vagy szűréssel választhatjuk el és további lebontásokhoz újra felhasználhatjuk. Az enzimatikus lebontás során képződött 35 6-aminopenicillánsavat kristályosan kapjuk, ha a reakcióelegyből, amelyet az oldhatatlan enzimtől elválasztottunk és vákuumban betöményítettünk, az izoelektromos ponton 4,3 pH-értéken lecsapjuk. 40 Lényegesen nagyobb kitermeléssel kapjuk a 6-aminopenicillánsavat, ha a G-penicillin hasítását a találmány szerinti oldhatatlan enzimkészítménnyel végezzük, mint ha E. coli szuszpenziót alkalmazunk. Amint azt a példa is mutatja, a 45 6-aminopenicillánsavat az oldhatatlan penicillinaciláz többszöri beadagolása esetén átlagosan 87% kitermeléssel különítjük el, míg E. coli szuszpenzió alkalmazása esetén a kitermelés 70—75%. A termék tisztasága a találmány szerinti eljárás 50 esetén átlagosan 97%. Az így előállított 6-aminopenicillánsav szennyezésként nem tartalmaz proteineket, így a proteinekre visszavezethető allergiás mellékhatások a találmány szerinti eljárással előállított 6-aminopenicillánsav esetén nem lépnek fel 55 A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa 60 6-Aminopenicillánsav előállítása 57 g nedves, hordozóhoz kötött, 0,044 egység/mg specifikus aktivitású penicillinacilázt és 65 160 g G-penicillin-káliumot egymás után beada-2
