165651. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására G-penicillin-enzimatikus lebontása útján

5 165651 6 gólunk 2500 ml vízbe és 38C°-on keverjük. Az elegyet trietilamin hozzáadása után 7,8 pH értéken tartjuk. 12 óra múlva az elegy nem vesz fel több trietilamint. A hordozóhoz kötött enzimet leszűrjük, 100 ml vízzel és 100 ml 0,2 5 mólos konyhasó-oldattal mossuk és további lebontáshoz újra beadagoljuk. A szürletet és a mosóvizet vákuumban 300 ml térfogatra bepároljuk és a 6-aminopenicillánsavat az izoelektromos ponton 4,3 pH értéken 500 ml io metilizobutilketon jelenlétében kicsapjuk. 3 órán keresztül 5 C°-on állni hagyjuk, majd leszűrjük és 200 ml vízzel, majd 200 ml acetonnal mossuk. Vákuumban 40 CT-on szárítjuk. Olvadáspont: 208 C°, kitermelés: 88,3%. 15 A hordozóhoz kötött penicillinacilázt a fenti módon egymást követően tíz alkalommal adagoltuk be G-penicillin enzimatikus lebontásához. A kapott kitermeléseket az alábbiakban adjuk meg: 20 2. lebontás kitermelés: 87,8% 3. lebontás 86,3% 4. lebontás 88,2% 5. lebontás 87,5% 6. lebontás 86,9% 7. lebontás 88,1% 8. lebontás 87,5% 9. lebontás 85,0% 10. lebontás 86,5% átlagosan 87,2% 2. példa 35 110 g nedves, hordozóhoz kötött, 0,044 egység/mg specifikus aktivitású penicillinacilázt az 1. példa ' szerinti módon 6 órán keresztül keverünk 38C°-on és 7,8 pH-értéken 2500 ml 40 vízben 160 g G-pemcillin-káliummal. 6-Aminopenicillánsav kitermelés: 89,5%. 3. példa 45 30 g nedves, hordozóhoz kötött, 0,044 egység/mg specifikus aktivitású penicillinacilázt az 1. példa szerinti módon 20 órán keresztül keverünk 38C°-oh és 7,8 pH-értéken 2500 ml 50 vízben 160 g G-penicillin-káliummal. 6-aminopenicillánsav kitermelés: 86,1%. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, hordozóhoz kötött penicillinacilázt az alábbi módon állíthatjuk elő: 55 450 g akrilamidot, 30 g N,N'-metilén-biszakrilamidot és 150g maleinsavat feloldunk 3500 ml, 0,05 m foszfát-pufferben (pH = 7,6), és nitrogén védőgáz atmoszférában összekeverjük 150 ml 5%-os vizes propionsavnitril-oldattal és 150 ml 60 5%-os ammóniumperoxidiszulfát-oldattal. A reak-A kiadáséit felel: a Közgazdasági é 756392-Zrínj cióelegyet 80C°-ra melegítjük, majd 15 órán át szobahőmérsékleten tartjuk és átnyomjuk «gy 0,5 mm lyukbőségű szitán. Ezután a polimerizátumot vízzel jól kimossuk, fagyasztva számítjuk és 20 torr vákuumban 2 órán át melegítjük 180C°-on. 1,0 g 15 E/mg specifikus aktivitású, mikróbás eredetű, E. coli-bői izolált penicillinacilázt feloldunk 200 ml 0,01 pufferben (pH = 5,8), és 4C°-on 5 óra alatt keverés közben összekeverjük 15 g fenti módon előállított, kis részletekben adagolt keverék-polimerizátummal. A pH-t híg nátriumhidroxid-oldat adagolásával 5,8 értéken tartjuk. Az elegyet 24 órán 4C°-on tartjuk, majd a terméket leszűrjük és 300 ml vízzel mossuk. Hozam: 290 g nedves, hordozóhoz kötött enzim, amelynek aktivitása 0,044 E/mg. A penicillinacilázt az alábbi módon állítjuk elő. ATCC 11 105 jelzésű E. coli sejteket az 1 111 778 sz. NSZK-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon tenyésztünk, fenilecetsav hozzáadásával. Ezután a tenyésztő oldatot centrifugálással 1/10 térfogatra betöményítjük, és a sejteket 3% metilizobutilketon hozzáadásával és 3 órás keveréssel 7,5 pH-értéken feltárjuk. A feltárt sejtek szuszpenzióját kénsawal 5,0 pH-értékre beállítjuk és" élesre centrifugáljuk. A felső folyadékot sómentesített vízzel 5 mS/cm specifikus vezetőképességre hígítjuk. Ezután a penicillinaciláz adszorpciójához éppen elegendő mennyiségű bentonittal (Typ BII, gyártja az Erbslöh cég) összekeverjük, (körülbelül 6 g/l). 30 perc múlva a bentonitot centrifugálással elválasztjuk, majd 5 térfogatrész 0,5 m, 8,0 pH-értékű nátriumfoszfáttal egy órán át eluáljuk. Ezután a bentonitot centrifugálással elválasztjuk, a penicillinacilázt tartalmazó eluátum pH-ját 6—7-re beállítjuk és sómentesített vízzel szemben dializáljuk. Az enzimatikus aktivitás fagyasztva szárítás után 15 E/mg. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás 6-aminopenicillánsav előállítására G-penicülin mikróbás eredetű, E. coli-ból izolált, hordozóhoz kötött penicillinacilázzal való enzimatikus lebontása útján, azzal jellemezve, hogy a G-penicillin oldatot 6—8, előnyösen 7-7,8 pH-értéken és 20-50 C°, előnyösen 38 C° hőmérsékleten 3—20 órán keresztül olyan penicillinaciláz-szuszpenzióval hozzuk érintkezésbe, amelyben az enzim kovalens kötéssel kapcsolódik egy akrilamidból, , N,N'-metilén-bisz-akrilamidból és maleinsavanhidridből álló keverék-polimerizátumhoz, a savas elegyet semlegesítjük és a 6-aminopenicillánsavat ismert módon elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a savas elegy semlegesítésére szerves aminokat, előnyösen trietilamint alkalmazunk. Jogi Könyvkiadó igazgatója i Nyomda 3