165648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás O-hidroxi-benzoesav alapú homo polimerek és enzimek komplexeinek előállítására
*•> 7 165648 8 centrifugáljuk és így poli-4-sav - dehidrogenázlaktát komplexet, illetve poli-4-sav-dehidrogenázlaktát- borát komplexet kapunk. Szabad poli-4-sav és poli-4-sav-borát-komplex előállítása A fenti kísérletnél használt polimereket az alábbi módon állítjuk elő. Nátrium-4-aminoszalicilátot (400 g) és nátrium-hidrogénkarbonátot (60 g) 250 ml desztillált vízben feloldunk és a kapott oldatot 1 órán át keverjük. Ezután először 20 ml, majd 10 ml akriloil-kloridot adunk az oldathoz, az egyes adagolások további 1—1 órán át keverjük az oldatot. Az így kapott oldatot ezután 10 n sósavval gyengén megsavanyítjuk (pH 4-5), szűrjük és 500 ml desztillált vízzel mossuk. Vizes etanolból végzett átkristályosítás eredményeképpen 27,0 g N-akriloil-4-amino-szalicilsavat kapunk. A termék olvadáspontja 227-229 C . Elemzési eredmények: a C10 H 9 O 4 N képletre számított: C = 58,0%, H = 4,35%, N = 6,76%, talált: C = 57,7%, H = 4,35%, N = 6,65%. N-akriloil-4-amino-szalicilsavat (15,0 g) és boraxot (9,36 g) 180 ml desztillált vízben feloldunk és a kapott oldat pH értékét 10 n nátriumhidroxiddal 9-re beállítjuk. Az oldathoz azo-bisz-izobutironitril (150 mg) etanollal (50 ml) készült oldatát adjuk és a kapott reakcióelegyet 80C°-on 48 órán át visszafolyató hűtő alkalmazásával forraljuk. A kapott viszkózus oldatot 200 ml desztillált vízzel hígítjuk, majd pH értékét 5n sósavval 2-re beállítjuk, amikor is nehéz fehér pelyhek alakjában fehér polimer csapódik ki. A polimert kiszűrjük és tízszer 1 liter desztillált vízzel dekantálás útján mossuk. A polimert ezután metanollal forgó szárítón bepároljuk a reakcióba nem lépett bórsav eltávolítására. A polimert desztillált vizes (200 ml) szuszpenziója formájában tároljuk. A polimer %-os víztartalmának meghatározására a szűrt polimerből mintát veszünk, a minta súlyát megmérjük, majd foszforpentoxid felett vákuumban 60C°-on megszárítjuk. A szárítás eredményeképpen kemény, rideg, barna és áttetsző szilárd anyagot kapunk. A szűrt polimer 93súly% vizet tartalmaz. A polimer borát-komplexét úgy állítjuk elő, hogy a szűrt polimert (93%H2 0, 500 mg) borax (100 mg/ml) vizes oldatában (1,0 ml) szuszpendáljuk. A kapott elegy pH értékét 7,0-ra állítjuk be, és a polimert centrifugálás útján elkülönítjük. A komplexbe nem vitt polimert úgy állítjuk elő, hogy a szűrt polimert (93%H2 0, 500 mg) desztillált vízben (1,0 ml) szuszpendáljuk. A szuszpenzió pH értékét 7,0-re állítjuk, a mintát centrifugáljuk és a felülúszó fázist elkülönítjük. A borát-komplexbe vitt polimert előállíthatjuk úgy is, hogy az N-akriloil-4-amino-szalicilsav (5g) polimerizált viszkózus oldatát desztillált vízzel (70 ml) hígítjuk és a kapott oldatot 48 órán át 10 adag (5-5 literes mindegyik) 0,0005 mólos borát-pufferrel (pH 7,0) szemben dializáljuk. 5 Dehidrogenáz-laktát eltávolítása a poli-4-sav — dehidrogenáz-laktát-komplexből A poli-4-sav és a dehidrogenáz-laktát fenti ismertetett módon előállított szuszpenziójából vett 10 mintát centrifugáljuk és a felülúszó fázis aliquot részét megmintázzuk. A megmaradt felülúszó fázisból a polimert elkülönítjük, majd a polimert háromszor desztillált vízzel (l-l ml), végül 1 mólos tejsavoldattal (1 ml) mossuk. A dehid-15 rogenáz-laktát meghatározását az egyes mosásoknál vett aliquotokban (500/id) piroszőlősavra végezzük piroszőlősavas nátriumsó (0,4 mól) desztillált vízzel (1,0 ml) készült oldatát használva. Kontroll meghatározásokat végzünk az említett piroszőlősavas 20 nátriumsó oldatát (A kontrollminta) és piroszőlősavas nátriumsó 1 mólos tejsavas oldatát (0,4 mól l,0ml-ben) használva (B kontrollminta). A kapott eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg. Kezdeti Végső O. S. O. S. Különbség 340nm-en 340nm-en Felülúszó fázis közvetlenül a centrifugálás után 1.240 0.630 0.610 1. vizes mosás 1.200 0.910 0.290 2. vizes mosás 1.140 0.940 0.200 3. vizes mosás 1.100 0.960 0.140 tejsavas mosás 1.100 0.215 0.885 A kontrollminta 1.204 0.162 1.042 B kontrollminta 1.170 0.136 1.034 A fenti eredmények bizonyítják, hogy a poli-4-sav a dehidrogenáz-laktáttal komplexet képez, továbbá, hogy a dehidrogenáz-laktátot ezek-45 bői a komplexekből erős enzim-szubsztráttal végzett mosással, így tejsavas mosással el lehet különíteni. Megjegyezzük továbbá, hogy ez esetben a polimer-enzim komplex enzimaktivitást nem mu-50 tat, az enzim azonban a komplexből eltávolítva hatásos. A szilárd halmazállapotú enzim aktivitásának hiányát feltételezhetően a polimer o-hidroxi-sav csoportjának és a tejsav a-hidroxi-savcsoportjának szerkezeti hasonlósága magyarázza. 2. példa Szabad poli-4-sav és poli-5-sav reakciója de-60 hidrogenáz-laktáttal és glükamilázzal a) Poli-5-savat (5g) 10 ml desztillált vízben diszpergálunk sejtszövet-őrlő berendezéssel. A diszpergált polimer (1 ml) aliquot részeinek pH-ját 65 5 n sósavval vagy nátriumhidroxiddal a kívánt 4
