165648. lajstromszámú szabadalom • Eljárás O-hidroxi-benzoesav alapú homo polimerek és enzimek komplexeinek előállítására
165648 10 értékekre beállítjuk. Dehidrogenáz-laktát (10 jul) oldatait adjuk mindegyik aliquot részhez és a centrifugálás előtt fél órán át állni hagyjuk az így kapott mintákat. A megmaradt polimer-diszperziót kétszer ,1 ml desztillált vízzel mossuk, minden mosás után centrifugálunk. Végül a diszpergált polimert kétszer 1 mólos tejsavval (1 ml) mossuk és centrifugáljuk. Minden egyes felülúszó fázisban a dehidrogenáz-laktát aktivitást meghatározzuk. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban ábrázoljuk. pH Első felülúszó fázis 1. mosás 2. mosás Tej savas mosás 2 0.93 3 0.73 4 0.54 5 0.45 6 0.20 7 0.00 8 0.07 9 0.07 0.91 0.66 0.30 0.16 0.11 0.25 0.20 0.13 1.06 0.05 0.26 0.34 0.14 0.29 0.26 0.00 A kapott eredményekből látható, hogy növekvő pH érték esetén 2-9 pH között a poli-5-sav növekvő mértékben képes dehidrogenázlaktátot komplexbe vinni. b) A szuszpendált polimer aliquot részét (2 ml) centrifugáljuk és a centrifugálási maradékot kétszer acetát-pufferrel mossuk (pH 4,5). Glükamiláz (18,6jug/ml) vizes oldatát (1,0 ml) dehidrogenázlaktátot (lOjul) adunk a polimerhez és a kapott keveréket centrifugáljuk. A centrifugálási maradékot kétszer vízzel (1,0 ml), majd 1 mólos tejsavval mossuk, minden mosás után centrifugálunk. Az egyes felülúszó fázisokban az enzim beadagolása után meghatározzuk a dehidrogenázlaktát és glükamiláz aktivitást. A kapott eredményeket az alábbi táblázatban ábrázoljuk. (A glükamiláz, vagy más néven y-amiláz szállítója a Glaxo Laboratories cég, Greenford, Middlesex, Nagy-Britannia, a termék márkaneve „Agidex" és aktivitása mintegy 55 aktivitásegység/mg.) Dehidrogenáz-laktát aktivitás Első felülúszó fázis 1. mosás 2. mosás 1 mólos tejsavas mosás Glükamiláz aktivitás O. S. különbségek 340 nm-en 0,09 0,37 0,04 1,67 Első felülúszó fázis 1. mosás 2. mosás 1 mólos tejsava mosás O. S. különbségek 460 nm-en 0,609 0,235 0,039 0,060 A fenti eredmények alapján megállapítható, hogy a poli-5-sav a dehidrogenáz-laktátot nagyobb mértékben viszi komplexbe, mint a glükamilázt. Látható továbbá, hogy ezúton lehetséges az említett két enzim szétválasztása. c) Az a) részben ismertetett eljárást poli-4-savat használva megismételjük és így az alábbi eredményeket kapjuk. 10 15 (O. S.-különbségek 340 nm-en) 1.08 1.15 1.25 1.49 1.15 1.53 1.36 1.45 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 f,?}° - , - Tejsavas feluluszo 1. mosás 2. mosás „Loá« fázis mosas (O. S. különbségek 340 nm-en) 0.80 0.52 0.46 0.68 0.79 0.43 0.40 0.80 0.42 0.40 0.26 0.80 0.10 0.24 0.00 0.90 0.20 0.00 0.10 0.92 0.07 0.11 0.00 0.92 pH (a poli-4-sav pH 7 körül kezd gélt képezni) Standard: 0,92. A fenti eredmények alapján megállapítható, hogy pH 2—7 között növekvő pH érték esetén a poli-4-sav a dehidrogenáz-laktátot növekvő mértékben viszi komplexbe. d) A példa b) részében ismertetett módon poli-4-savat használva az alábbi eredményeket kapjuk. Dehidrogenáz-laktát aktivitása Első felülúszó fázis 1. vizes mosás 2. vizes mosás 1 mólos tejsavas mosás Glükamiláz aktivitása Első felülúszó fázis 1. vizes mosás 2. vizes mosás 1 mólos tejsavas mosás O. S. különbségek 340 nm-en 0.32 0.20 0.10 0.85 Aktivitás1 ) (mg/l/m) 15 5 0 0 1 Standard keményítő-oldatból kiválasztott glükóz súlya. A fenti eredményekből megállapítható, hogy poli-4-sav a dehidrogenáz-laktátot nagyobb mértékben képes komplexbe vinni, mint a glükamilázt. Látható továbbá, hogy ezúton a két enzim egymástól elkülöníthető. e) A példa b) részében ismertetett módon a kísérletet megismételjük, ez esetben azonban csak glükamilázt használunk (1 ml,»» 18,6 /ug/ml) és a 5
