165617. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új amfotericin B-komplexek előállítására

3 165617 4 oldhatóvá tett amfotericin B-t úgy kapjuk, hogy kalciumionokat adunk amfotericin B vízmentes, legfeljebb 1% vizet tartalmazó alkoholos oldatához, majd az A) eljárásváltozat szerint járunk el. A kalciumionok oldható só, például kalcium- 5 klorid alakjában adhatók hozzá. Egy mól amfotericin B-re 0,2-0,8 mól, előnyösen 0,4—0,6 mól, legelőnyösebben 0,5 mól kalciumiont adunk. C)Az amfotericin B harmadik típusa amfote- 10 ricint B-t, kalciumionokat, és legfeljebb 4 szénatomos dikarbonsav anionjait tartalmazza. Az amfotericin B ilyen stabilizált, oldhatóvá tett típusának előállítására kalciumionokat és egy szerves karbonsavat adunk amfotericin B víz- is mentes, legfejlebb 1% vizet tartalmazó alkoholos oldatához. A sav felhasználható szabad alakban, vagy egy oldható alkáli- vagy alkáliföldfémsója alakjában. A kalciumionokat ugyanolyan arányban adjuk az amfotericin B-hez, mint a B) eljárás- 20 változatban, a szerves karbonsavból pedig fölös mennyiséget, előnyösen 1 mól amfotericin B-re 0,5-20 mól savat adunk. Az amfotericin B alkáliföldfém komplexe megtartja az amfotericin B gombák elleni ha- 25 tékonyságát, állandó száraz alakban, és oldható vízben. Az alkáliföldfém komplex különleges előnye, hogy lehetővé teszi koncentráltabb vizes oldatok előállítását felhasználásra és feldolgozásra. Az ilyen koncentrált vizes oldatok alkalmasak 30 gombák elszaporodásának megakadályozására baromfiak emésztőcsatornájában azáltal, hogy az oldatot az állatok ivóvizébe adjuk, például -literenkét 2-28g arányban. Az amfotericin B komplexek önálló vegyület 35 jellegét a következő fizikai jellemzők bizonyítják: Az amfotericin B-oxalát — COO— csoportoknak megfelelő erős infravörös abszorpciós sávot mutat 6,2-6,3 ju-nál, viszont az amfotericin B-nek az 5,8—5,9 ju-nál jelentkező jellemző abszorpciós sávja 40 lakton- vagy észter-karbonilcsoport jelenlétét jelzi. A fő röntgendiffrakciós sávok helyzete: amfotericin B: d = 4,07, 5,23, amfotericin B-kalcium komplex (anion 45 nélkül): d = 4,15, 4,56, 4,75, 5,03, 9,2, 18,0, amfotericin B-kalciumoxalát komplex: d = 3,93, 4,39, 5,0, 5,94, 9,1, 15,7. Ultraibolya abszorpció 405 m/U-nál (Ej): 50 amfotericin B metanolos oldatban: Eí = 1800, amfotericin B-kalcium komplex: E} = 1652, amfotericin B-kalciumoxalát komplex: Ej = 1500. Oldhatóság vízben: 55 amfotericin B: 6—7 pH-nál oldhatatlan, 2 vagy 11 pH-nál literenként 100 mg oldódik a Merck Indexben közöltek szerint, amfotericin B-kalciumoxalát komplex: 6pH-nál literenként 430 mg, 8 pH-nál 560 mg oldódik. 60 Annak megállapítására, hogy egy komplex vagy a komponensek egyszerű fizikai keveréke van-e jelen, két módszer van: (a) a komplexek nagyon rosszul oldódnak trietilamin és metanol elegyében 9,5 pH-nál, viszont az amfotericin B nagyon jól 65 oldódik, (b) a komplexek kissé jobban oldódnak tiszta metanolban, mint trietanolamin és metanol elegyében, de oldhatóságuk csak fele az amfotericin B oldhatóságának azonos körülmények között. A következő példák szemléltetik a találmány szerint eljárás gyakorlati végrehajtását korlátozás szándéka nélkül. A hőmérsékleti adatokat Celsiusfokban közöljük. 1. példa Amfotericin B-kalciumoxalát komplex Közvetlenül a fermentléből előtisztítással és bepárlással kapott 717 g 35,0 g aktivitású nyers amfotericin B micéliumport és 0,85% kalciumot 39,9 ml 6 n sósav hozzáadásával feloldunk 14 liter metanolban. A 32,6 g aktivitást tartalmazó leszűrt oldathoz hozzáadjuk 35,0 g oxálsav 163 ml metanollal készült oldatát. Az oldat pH-ja ekkor 2,1. öt perc keverés után a pH-t 51 ml tömény vizes ammóniaoldattal beállítjuk 7,0-ra. Utána a keveréket 45—50° -on 1 óra hosszat keverjük. Ekkor a pH 6,6, és azt további tömény ammónia hozzáadásával visszaállítjuk 7,0 értékre. Utána a keveréket szobahőmérsékleten 2 óra hosszat állni hagyjuk, majd szűrjük, és a nedves, 95 g súlyú szűrőlepényt éjjelen át vákuumban 45-50°-on szárítva 33,1 g kristályos komplexet kapunk. Ebből a komplexből 2 pH-nál 1 liter vízben 3,44 g oldódik. A komplexnek 6,2-6,3 mikronnál infravörös abszorpciós sávja van, és röntgendiffrakciós spektruma van. Mikrokristályos cellulózon végzett vékonyréteges kromatografálás 20:20:1 arányú 1-pentanol-hangyasav-víz rendszerben ultraibolya megvilágításnál észlelve igazolja oxálsav jelenlétét (Rf = 0,2). A komplexből 100 mg-ot 750 ml metanolhoz adva 40%-a oldódik, összehasonlításképpen említjük, hogy 100 mg amfotericin B teljesen feloldódik 750 ml metanolban. Az új komplexből 100 mg-ot 80 ml metanolhoz adva, és a pH-t trietilaminnal 9,5-re beállítva az oldódás 35%-os, viszont 100 mg amfotericin B 80 ml metanolban teljesen feloldódik. 2 példa Amfotericin-B-sav-anion 40,0 g aktivitást tartalmazó 42,64 g amfotericin B-t 7,0 ml 5,8 n sósavval oldhatóvá teszünk 10 ml metanolban. A leszűrt oldathoz hozzáadjuk 40 g borostyánkősavnak 400 ml metanollal készült oldatát. A 4,05-re csökkent pH-t 29,6 ml tömény vizes ammóniával beállítjuk 7,0-re. A képződött kristályszuszpenziót 45-50° -ra melegítjük, 60 percig keverjük, 2 óra alatt szobahőmérsékletre hűtjük, szűrőre visszük, és a szűrőn maradt terméket 45-50°-on szárítjuk. Az így kapott 34,2 g kristályos komplexből 1 liter vízben 2pH-nál 28,0 g oldódik. Ezzel szemben az 2