165579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-( D-5-amino-5-karboxi-vleramido) -3- (karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav antibiotikum előállítására
7 165579 8 hozzáadása kémiailag definiált komplex szerves fermentáló közeghez fokozza a 7-[D-5-amino-5-karboxivaleramido-(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav termelést. Az antibiotikumtermelés serkentéséhez szükséges glicin, L-fenilalanin, II. általános képletű karbamát vagy III. általános képletű amid mennyisége az alkalmazott közegtől függ. Fokozott antibiotikum termelés figyelhető meg általában 0,01-0,10% (súly/térfogat) glicin és 0,05-0,3% (súly/térfogat) L-fenilalanint tartalmazó közegben. Előnyös koncentrációk azonban 0,05% glicin és 0,3% L-fenilalanin. A II. általános képletű karbamátokat és a III. általános képletű amidokat mintegy 0,0156—2,0%-ban alkalmazzuk, és különösen jó hozam érhető el N-2-hidroxietilalkilkarbamátokkal, például 0,2-0,8% etü-N-2-hidroxietil-karbamáttal. Azt találtuk még, hogy a fermentáló közeghez a Illa. általános képletű amid-vegyületet, mely képletben Re jelentése hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkil-csoport, például metilvagy etil-csoport, és R7 és R g jelentése hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkil-csoport, például különösen az izobutil-csoport, adagolva jelentős antibiotikum hozamnövekedés következik be. Az N,N-diizobutilpropionamid különösen előnyös, és kiemelkedő hozam érhető el az alkalmazott közegre számított 0,063-0,125%-os koncentrációban használva. A glicin 0,3%-ot, az l-fenilalanin 0,5%-ot és a karbamátok 0,8%-ot meghaladó koncentrációi az antibiotikum-hozamot csökkenteni hajlamosak. Ezen túlmenően azt találtuk, hogy a glicin, L-fenilalanin és a II. általános képletű karbamát és/vagy III. általános képletű amid egymással is kombinálható olyan adalék létrehozására, mely különösen jó antibiotikum-hozamot segít elő. így például 0,05% glicin, 0,3% L-fenilalanin és 0,0156-2,0% közötti II. általános képletű karbamát és/vagy III. általános képletű amid kombinálásával az antibiotikum hozamának növelésére Tcülönösen megfelelő végső koncentrációt kapunk. E kombinációban a karbamátot, előnyösen az etü-N-2-hidroxi-etükarbamátot 0,2-0,8% végső koncentrációban és az amidot, előnyösen az N,N-diizobutilpropionamidot 0,063-0,125% koncentrációban alkalmazzuk. Az előbbiek során megtárgyaltak főleg a Streptomyces lactamdurans parens törzsét használó fermentálásokra mérvadók. De ezen mikroorganizmus egyéb törzsei is, például mutánsai is használhatók az antibiotikum termelésére. A szakmában jártas szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a II. általános képletű karbamát vagy a III. általános képletű amid adalékanyag oly módon is használható az antibiotikum hozamnövelésére, hogy a fermentlébe adagoljuk. A jelen találmány ismertetését követve, az adalékanyag optimális szintjeinek nyilvánvaló módosításai vagy változtatásai, a fermentálás alatti adagolási idő stb. a szakmában jártas szakember szaktudásához tartozik, függetlenül attól, hogy az I. képletű 7 - [ D- 5 -amino-5-karboxivaleramido(-3-)karbamoiloxirnetil]-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav előállítására S milyen Streptomyces lactamdurans törzset használunk. Bár a találmány tárgyát képező I. képletű antibiotikum egyaránt előállítható felszíni és felszín alatti tenyészetekkel is, jelenleg előnyösebb 10 a fermentálás kivitelezése felszín alatti módszerrel. Kisméretű fermentálások megfelelően végezhetők el oly módon, hogy a tápközeg alkalmas mennyiségeit lombikokba helyezzük, a lombikokat és tartalmukat 120C°-ra hevítéssel sterilizáljuk, 15 beoltjuk a lombikok tartalmát a 7-[D-5-amino-5-karboxivaleramido(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsavat termelő Streptomyces törzs spóráival vagy vegetatív sejtszaporulatával, a lombikok nyílását gyapottal lazán ledugaszoljuk és 20 a fermentálást állandó, 28 C° körüli szobahőmérsékleten 3—5 napig rázógépen végezzük. Nagy méretben való fermentáláskor a fermentálás folyamatát előnyös keverővel és a fermentáló közeg levegőztetésére szolgáló szerkezettel felszerelt ké-25 szülékben végezni. E módszer szerint a tápközeget a tartályba töltjük és 120C° hőmérsékleten sterilizáljuk. Lehűtés után a sterilizált közeget megfelelő eredetű Streptomyces vegetatív sejtszaporulatával beoltjuk, és a fermentálást 2-4 30 napig folytatjuk, miközben gondoskodunk a tápközeg keveréséről és/vagy levegőztetéséről. Ezen idő alatt a hőmérsékletet 28 C° körüli hőmérsékleten tartjuk. A 7-[D-5-amino-5-karboxivaleramido(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-35 4-karbonsav előállításának ez a módszere különösen alkalmas az új antibiotikum nagy mennyiségeinek készítésére. A 7-[I>5-amino-5-karboxivaleramido(-3-)karbamoüoximetü]-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsavat ter-40 melő mikroorganizmus használatával a fermentálás 20-37 C° közötti hőmérsékleten végezhető. Optimális eredmények elérésére azonban a fermentálást előnyösen 26-30 C° közötti hőmérséklettartományban végezzük. A Streptomyces szapo-45 rodásához és az antibiotikum termeléséhez megfelelő tápközeg pH-értéke 5—9 között változtatható. Előnyös pH tartomány azonban 6,0 és 7,5 között van. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a 50 7-[D-5-amino-5-karboxivalerarnido(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsavat termelő mikroorganizmus ferdeagar tenyészetéhez steril táptalajt adunk, mely módon sejtszuszpenziót készítünk. A ferde-tenyészet szaporulatát ezután az 55 oltólombik beoltására használjuk, és a jó szaporulat elérésére az oltólombikot 1-^3 napig 28 C° hőmérsékleten tartva rázógépen rázzuk. Ezt az oltólombikot használjuk ezután a termelőlombikok beoltására. Változatként az oltólombikot 60 beolthatjuk liofilizált tenyészettel vagy fagyasztott oltóanyaggal is. A beoltást általában kb. 1 ml oltóanyaggal végezzük 40 ml termelő közegre számítva. Az adalékot ezután a szükséges koncentrációban 65 bevisszük a termelő lombikokba és a fermentálást 4
