165579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 7-( D-5-amino-5-karboxi-vleramido) -3- (karbamoiloximetil)-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav antibiotikum előállítására

165579 9 10 2—4 napig végezzük a tápközeg keverése és/vagy levegőztetése közben, mialatt a hőmérsékletet 28 C° körüli értéken tartjuk. Ezen idő elteltével -általában 96 óra után - az összes lombikokat, az adalékot tartalmazókat és a kontrollként 5 használtakat egyaránt, megvizsgáljuk annak megállapítására, hogy az egyes lombikokban mennyi antibiotikum termelődött. A 7-[D-5-amino-5-karboxivaleramido(-3-)karbamoiloximetü] -7-metoxi*3-cefém-4-karbonsav anti- io biotikumot megfelelően korongvizsgálattal értékeljük, 9,5 mm átmérőjű korongokat és vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans MB 1272 (ATCC 8461>t használva. Szabványos görbét szerkesztünk az antibiotikum ismert koncentrációiból, 15 és az aktivitást a szabad sav milliliterére vett mikrogrammban, vagypedig mg/ml-ben fejezzük ki. A termelő lombikokat ezután megvizsgáljuk oly módon, hogy a mintát 0,02 moláris foszfátpufferben pH 7 értéken megfelelő koncentrációig 20 oldjuk. A vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans MB-1272 (ATCC 8461>et használunk, vizsgálati közegként Difco táp-agar és 0,2% Difco élesztőextraktum szolgál. A korongokat 5 mg/ml szabványos antibiotikum-oldatba merítjük és a 25 mintának megfelelően helyezzük a lemezre. A lemezeket ezután 37 C° hőmérsékleten 18 óra hosszat inkubáljuk, és a zónaátmérőket milliméterben kifejezve meghatározzuk. Öt szabványos lemezt alkalmazunk 2,5—20jug/ml közötti négyféle 30 szabvány szinttel. A vizsgálatot nomogramm segítségével számítjuk, és az eredményeket /ig/szabad-sav ml-ben fejezzük ki. Az antibiotikum a fermentáló közegből számos 35 módszerrel kinyerhető. A szűrt lé átbocsájtható egy vagy több ioncserélő oszlopon. Az I. képletű antibiotikum amfoter természete lehetővé teszi - az optimális kinyerés elérésére - mind a kationt, mind az anioncserélő gyanták használatát. 40 Az adszorbeált antibiotikum ezután a gyantából előnyösen illó oldószerben, például piridinben való mosással eluálható. A piridin könnyen elkülöníthető. Az I. képletű 7-[D-5-amino-5-karboxivaler- 45 amido(-3-)karbamoiloximetil]-7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav és sói hatékonyan a különböző Gram-negatív és Gram-pozitív mikroorganizmusok szaporodásának gátlásában. Az alábbi példák a találmány tárgyát köze- 50 lebbröl szemléltetik, de annak hatóterületét nem korlátozzák. 1. példa 55 Antibiotikum termelés, glicin adagolása Módosított fermentálási eljárás, A-lépés: Ferde-tenyészetek 60 Streptomyces lactamdurans tenyészet (NRRL-3802) liofilizált csövét aszeptikusán felnyitjuk és a mikroorganizmust a következő összetételű közegbe visszük át: 65 I. Közeg 1% melasz 1% National Brewer's élesztő (National Brewer's Company USA) 2,5% Difcio-agar, (Difco Company, Detroit) pH érték 7,0 vízzel feltöltve a szükséges térfogatra. A ferde tenyészeteket néhány napon át 28 C° hőmérsékleten inkubáljuk. Hidegben tárolva a ferde-tenyészet 13 hetet meghaladó ideig stabil. B-Lépés: Beoltási szakaszok, Kétlépcsős rendszer Első oltás: Az első oltást közvetlenül az A-lépés ferde-tenyészetéből végezzük 250 ml-es ledugaszolható Erlenmeyer lombikokba, 40 ml eredeti szárított élesztő NF-hez adva, pH 7,0 (a Yeast Product Corporation terméke). A ledugaszolt lombikokat ezután 2—3 napig 5 cm kitérésű, 220 ford/perc sebességű forgó rázógépen rázatjuk. Második oltás: Az első oltási szakaszból származó 2,5% oltóanyagot (hatóközeg térfogatára vonatkoztatva) adunk 2% Fleischmann S-l 50 (Fleischmann Yeast Company, Stancford) élesztő autolizátumot tartalmazó lombikba, pH = 7,0. A szaporodás e szakaszban jellegzetesen könnyen megy végbe, és az inkubálást — az első lépéshez hasonlóan 28 C° hőmérsékleten legfeljebb 48 óráig végezzük. C-lépés: Alap termelőközeg Az alap termelőközeg összetétele a következő: II. közeg: Desztillációs maradék 3,0% eredeti szárított élesztő 0,75% Mobil Par-S habzásgátló (Mobü Oü Company, New York) 0,25%. E közeget pH 7,0 értékre kismennyiségű koncentrált nátriurnhidroxid oldattal beállítjuk, Erlenmeyer lombikokba szétosztjuk és 15-20 percig 121 C° hőmérsékleten autoklávba helyezzük. A kapott közeg hűtése után a második lépésben kapott második oltási szakaszból származó 2,5% oltóanyagot adagolunk a lombikokba. Az inkubálást 3 napig végezzük 28 C° hőmérsékleten 5 cm kitérésű, 220 ford./perc sebességű forgó rázógépen. A fermentálás befejezte után a sejteket centrifugálással elkülönítjük és a fermentlét foszfátpufferrel hígítjuk, pH érték 7,0. A fermentlében levő 7-[D-5-amino-5-karboxivaleramido(-3-)kabb amoiloximetil] -7-metoxi-3-cefém-4-karbonsav koncentrációját a szabványos biológiai korongvizsgálati módszerrel határozzuk meg. Vizsgálati mikroorganizmusként Vibrio percolans (ATCC 8461)-et használunk. A szűrőpapír korongokat a hígított fermentlébe merítjük és agartartalmú Petri-csészék felületére helyezzük, ame-5