165526. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-4696-jelű új antibiotikum előállítására
165526 13 14 majd 250/perc fordulatszámú rázóasztalon, 30 C° hőmérsékleten további 24 órán át inkubálunk. 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 100 ml alábbi összetételű táptalajt sterilezőnk (120 C°, 30 perc), és beoltjuk a fenti tenyészet 0,4 miével: déxtróz 1,0 % dextrin 3,0 % pepton 1,5 '% szójaliszt 0,5 »/» MgS04 -7H 2 0 0,2 % melasz 1,5 % kukoricalekvár 0,5 0/0 betain 0,1 % K2HPO4 0,050/0 desztillált víz 25 ml A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 5 N nátriumhidroxiddal 7,5-re állítjuk. Sterilezés után a táptalaj pH-ja fcb. 6,9. Az antibiotikum előállítására a tenyészetet 96 órán át, 30 C°-on, 250/perc fordulatszámú razóasztalon rázatjuk. A tenyésztés végén a fermentációs táptalaj pH-ja 7,2. Az 1. példa A) pontja szerinti eljárással inokulumot készítünk. A fenti összetételű termelő táptalaj 25 literét, 0,02% „Dow Corning"' habzásgátlóval kiegészítve, 120 C°-on, 30 percen át sterilezzük, majd 40 liter térfogatú fermentorba nyomatjuk. A steril táptalajt 100 ml előkészített vegetatív inokulummal oltjuk, és 4 napon át, 30 C° hőmérsékleten fermentálunk. A levegőztetést úgy állítjuk be, hogy az legalább fél térfogat levegő/táptalajtérfogat/perc legyen. A fermentációs táptalajt 370/perc fordulatszámmal kevertetjük, hogy á levegő és a táptalaj megfelelő keveredése biztosítva legyen. A tenyészet pH-ja a fermentáció során a kezdeti 6,9-es értékről fokozatosan 7,2-re emelkedik. C) Az A—4696 jelű antibiotikum izolálása. Az 1. példa szerinti módon kapott fermentlevet teljes egészében, Celite hozzáadása után, leszűrjük. A szürletet félretesszük. A micéliumtömeget 32 liter vízzel mossuk, és a mosófolyadékot félretesszük. A micéliumtömeget ezután újabb 32 liter vízben szuszpendáljuk, és a szuszpenzió pH-ját 5 N nátriumhidroxid oldattal 10,5-re állítjuk. A vizes mieélium-szuszpenziót 45 percen át kevertetjük, majd megszűrjük. Ezt a szürletet egyesítjük a vizes mosófolyadékkal és az eredeti szürlettel, majd ennek a pH-ját kénsavval 4,0-re állítjuk. A. savanyított oldatot 1 kg aktívszénnel (Pittsburgh, 12X40) készített oszlopra visszük, majd ezt addig mossuk, míg az ehiátum színtelen nem lesz. Ezzel az eljárással a hatóanyagot az aktívszénen adszorbeáltuk. Ezután a hatóanyagot 1% kénsavat tartalmazó aceton : víz 1 :1 arányú elegyével eluáljuk a szénről. Az A—4696 jelű antibiotikumot tartalmazó eluátumot telített báriumhidroxid oldattal kezeljük, ekkor a szulfát-ionok báriumszulfát alakjában kicsapódnak az oldatból. A szuszpenziót megszűrjük, és a báriumszulfát csapadékot eltávolítjuk. Az antibiotikumot tartalmazó szürletet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. Az így kapott desztillációs maradék tartalmazza az A—4696 jelű hatóanyagot, súlya S0 g. D) A nyers A—4696-hidroklorid előállítása. A megközelítőleg 00 g desztillációs maradékot 5 liter vízben oldjuk, és 500 g aktívszénnel (Darco G—60, Atlas Chemical, Wilmington, Delaware) kezeljük. A szuszpenziót 1 órán át kevertetjük, majd megszűrjük. A szürletet kiontjuk, a szűrési maradékot — amely az antibiotikumot tartalmazza — 1 liter vízzel mossuk. A mosófölyadékot kiontjuk. A szenes szűrési maradékot 1 liter 0,05 N sósavoldattal mossuk. A savas mosófolyadékot kiontjuk. A megmosott szenes szűrési maradékot 500 ml vizes, sósavas, acetonos eleggyel kezeljük, ((0,05 N HCl : aceton = 7:3) oly módon, hogy 30 percen át keverjük. A szuszpenziót ezután megszűrjük, és a szürletet félretesszük. Az aktívszénen adszorbeált antibiotikum eluálását hasonló módon még négyszer megismételjük. Az A—4696 jelű antibiotikumot tartalmazó öt eluátumot egyesítjük. Az «egyesített oldatot ezután csökkentett nyomáson 100 ml térfogatra pároljuk be, majd 200 ml metanolt adunk hozzá. Ezután a vizes-metanolos oldathoz 2 liter acetont adunk, amikor a nyers A—4696-hidroklorid kicsapódik az oldatból. Szűrés és szárítás után 60,9 g nyers A— 4696-hidroklorid keletkezik. E) A kristályos A—4696-hidroklorid előállítása. Az 1. példa D) pontja szerinti eljárással előállított A—4696-hidroklorid 25 g-ját 25 ml vízben oldjuk. Az A~46964iidroklorid oldatot egy 7X60 cm méretű, vízzel mosott poliamid gyantát (Woelm, M., Eschwege, NSzK) tartalmazó oszlopon engedjük át. A gyantaágyat ezután vízzel mossuk, az átfolyási sebesség 8—10 ml/ /perc. Az eluátumok mikrobiológiai aktivitását az ismert módszerekkel mérjük. Az aktív anyagot tartalmazó eluátumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson ledesztilláljuk a vizet. A desztillációs maradékot 25 ml víz és 50 ml metanol elegyében oldjuk. Az A—4696-hidroklorid vizes metanolos oldatát ezután 5 N sósavval pH 2-re savanyítjuk. Kb. 1,5 1 acetont adunk a megsavanyított oldathoz, amikor az A—4696 jelű antibiotikum sósavas sója kicsapódik. A szuszpenziót ezután megszűrjük, és az A—4696-hidrokloridot elkülönítjük. Az A—4696-hidrokloridnak az előbb ismertetett eljárással készített csapadékát a lehető legkevesebb mennyiségű vízben oldjuk. A víz kétszeres térfogatának megfelelő mennyiségű eta• nolt adunk az oldathoz, majd felmelegítjük kb. 65 60 C°-ra. Lehűtéskor az A—4696-hidroklorid 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
