165478. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyagcseretermékek előállítására növényi sejtekből fermentációval

165478 MS táptalaj összetevők Koncentráció mg/ml vitamibiotin 0,1 nok kolin-klorid inoszitol nikotinsav pantoténsav piridoxin riboflavin tiamin 1 5 1 000 1 1' 1 1 10 1 auxinhatá&ú 2,4-diklór-fenoxi-e cetsav 6 anyag citokinin kinetin 0,06 15 desztillált víz ad 1 liter A táptalajt 20 percig kb. 1 at gőznyomással autoklávhan kezeljük. A leoltott lemezeket 25 °C-on mérsékelt fényben inkubáljuk; 3 hét eltelte 20 után az eredeti leoltott szöveteken csomós sejttenyészetek figyelhetők meg. Az esetleg penészszel vagy baktériummal szennyezett lemezeket eldobjuk. A tiszta tenyészeteken megjelenő hegsejteket 30 ml, előbbivel azonos agair táptalajt 25 tartalmazó 100 ml-es edénybe visszük, és azonos körülmények között további 5 hétig folytatjuk az inkubálást. Ez alatt az idő alatt a sejtek növekedése elegendő ahhoz, hogy további másodlagos tenyészeteket készítsünk belőlük. 30 2. példa Differenciálatlan sejtek tenyésztése folyékony 35 táptalajban és a kívánt sajátosságokkal rendelkező másodlagos tenyészet kiválasztása Néhány, az 1. példában leírt, másodlagos tenyészetet tartalmazó edényből kb. 8 mm átmérőjű sötétbarna hegszövetcsomót, 60 ml fenti összetételű, de agarmentes táptalajt tartalmazó, 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba viszünk. Ezeket az inokulumokat tartalmazó edényeket percenként 120, 25 mm-es kerületű forgó mozgást végző rázógépre helyezzük, és állandó közben, 26°C-Oin, szórt fényben 4 hétig inkubáljuk. Ez idő elteltével az egyes edényekben különböző eredményt észlelhetünk, ami az előző lépés egyenlőtlen válogatásának tulajdonítható. Egyes edényekben csak egy nagyobb csomó hegszövet látható, másokban az eredeti szövet mellett kisebb, láthatóan azonos sejtek találhatók, amelyek az eredeti metszetből nőttek ki és hasadtak le; további edényben eltérő külsejű, további elkülönülésre utaló sejteket találunk. A kisebb tenyészetet, valamint az anyaszövettől eltérő tenyészetet tartalmazó edényeket továbbtenyésztésre kiválasztjuk; ezeket 6 lépésben tovább tenyésztve és inkubálva megkapjuk a kívánt tulajdonságokkal rendelkező, a rázott edényekben gyorsan növekvő, pigmentálatlan egy-sejteket és 0,5 mm-nél kisebb átmérőjű kis aggregátumokat. Mikroszkópos vizsgálattal ezek az aggregátuniok nem mutatnak finomabb szer-45 10 kezetet, mint az alkotó sejtek. A növekedés üteme olyan mértékű, hogy az inokulumban levő, alig 1 térfogat%-ot kitevő sejtek 2 hétig tartó inkubálás után 20%-ra szaporodnak fel. Ezek a tulajdonságok azonos táptalajban, nagyobb méretű tenyésztésben is állandóiak maradnak. 3. példa A differenciálódó, növényiszerv-kezdemény tenyésztésének megindítása folyékony, süllyesztett, levegőztetett táptalajban A 2. példában kinyert, diszperz, pigmentálatlan, differenciálatlan Beta vulgáris-tenyészetet magában foglaló edény tartalmát ülepedni hagyjuk, majd a felülmaradó tiszta oldatot dekantáljuk és elöntjük. A leülepedett sejteket és sejtcsomókat kétszer 60 ml auxinmentes folyékony táptalajjal mossuk (az 1. példában leírt, de 2,4--diklór-fenoxi-ecetsavat és agart nem tartalmazó táptalaj), .majd a sejtanyag ülepedése után dekantáljuk. A mosott sejteket tíz, egyenként 60 ml auxinmentes táptalajt tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba osztjuk szét, az edényeket a fent leírt rázógépen 25 "C-on 3 hétig inkubáljuk. Ez alatt az idő alatt a sejtek és sejtcsomók számottevően megszaporodnak, a harmadik hét vége felé bekövetkezik a differenciálódás, amikor élénk narancs- és vörös színű részecskéket tartalmazó sűrű szuszpenziót kapunk; kis felbontású mikroszkóp alatt vizsgálva látható, hogy a részecskék csaknem teljesen kis gyökérkezdeményből állnak, amelyek bőségesen tartalmazzák a kiindulási anyagként felhasznált Beta vulgaris pigmentjeit. 40 4. példa A pigmentek elkülönítése Az előző példában, a tíz edényben nyert, gyökérkezdeményt tartalmazó sűrű szuszpenziót leszűrjük; ekkor az összes pigment a sejtfrakcióba kerül; a pigmentmentes szűrletet eldobjuk. A sejteket 500 ml vízzel újra szuszpendáljuk, az 50 elegyet felforraljuk, ekkor a pigmentek a sejtből kiszabadulnak és a folyadékba kerülnek. Szűréssel a feleslegessé vált sejteket eltávolítjuk, és a továbbiakban az élénkvörös színű szűrletet használjuk fel; ezt 2,5-szer 12,5 cm méretű Do-55 wex 50X2 védjegyű kationcserélő gyantaoszlopom átbocsátjuk, amely 5 cm széles vörös sávban, közel az oszlop tetejéhez, az összes pigmentet leköti. A pigmentet 1% nátrium-hidrogén-00 -karbonát-oldattal leoldjuk, az oldatot 5 pH-ra savanyítva a pigmenteket elkülönítjük és fagyasztással szárítjuk, majd ebből a szabad betanidin pigmentet metanollal kivonjuk. A betanidint növényi eredetű élelmiszer-színezékként 65 használhatjuk fel.