165478. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyagcseretermékek előállítására növényi sejtekből fermentációval

165478 11 5. példa Beta vulgaris-szervkezdemény tenyésztése gyobb méretben na-2. példa szerint mosott inokulumot készítünk, egy edény tartalmát 1 literes boroszilikát üvegedényben levő, 3. példa szerint készült 500 ml folyékony táptalaj beoltására használjuk. Miután 8 napig 120 fordulat/perc sebességgel 25 °C-on rázattuk az edényt, teljes tartalmát egy 20 literes boiroszilikát üvegedényben levő 10 liter, azonos összetételű inokulum beoltására használjuk fel. Ezt követően az elegyet mágneses keverővel keverjük, és a steril levegőt 1 liter/perc sebességgel alulról befúvatva inkubáljuk. A termék, a laboratóriumi méretben kapott gyökérkezdeményhez hasonló, vörös színű szuszpenzió. 6. példa Differenciálatlan Digitalis purpurea sejttenyészet készítése porzótenyészetből Szabadon termő Digitalis purpurea-ról zárt virágbimbót veszünk le, majd rövid ideig 1%-os nátrium-hipoiklorit-oldatba merítve, felületét sterilezzük. Aszeptikus körülmények között a bimbóból metszetet készítünk, ós a porzót 15 ml, az 1. példában leírt, szilárd MS táptalajt tartalmazó Petri-csésze agarfelületére visszük. 18 -napig tartó 28 °C-os inkubálás után a porzótenyészetben számos kis hegcsomó növekedése tapasztalható. További ,20 nap után a differenciálatlan sejtcsomók erélyes növekedése figyelhető meg. A hegcsomókat elkülönítjük és friss, azonos táptalajjal készült agarlemezekre visszük, ahol a tenyészetet további 14 napig tartjuk. 7. példa Differenciálatlan Digitalis purpurea sejttenyészet készítése rázóedényekben diszperz 25—-25 ml következő összetételű táptalajt tartalmazó öt Erlenmeyer-lombikot oltunk be a 6. példában, agarlemezen kapott, mintegy 8 mm átmérőjű hegcsomókkal. MMS táptalaj Koncentráció mg/l 950 185 220' 68 Összetevők kálium-nitrát magnézium-szulfát 7 H2

0 kalcium-klorid 2 H2

0 kálium-dihidrogén-foszfát Ezenkívül a táptalaj tartalmazza az MS táptalajban levő nyomelemeket, szacharózt, vitaminokat, auxinhatású vegyületet és citokinint. 18 napig tartó inkubálás után a legjobb és leginkább diszpergált tenyészeteket tartalmazó edények tartalmát egyesítjük, a sejtanyagot ülepítjük, a fentmaradó tiszta folyadékot leöntjük, a sejteket 50 ml friss, a következő összetételű auxinmentes MMSR táptalajjal mossuk. 12 MMSR táptalaj 10 15 20 25 30 Összetevők kálium-nitrát magnézium-szulfát 7 H2

0 kalciumnklorid 2 H2

0 kálium-dihidrogén-foszfát vas(II)-szulfát 7 H2

0 mangán-szulfát 7 H2

0 cink-szulfát 7 H2

0 bórsav ammónium-molibdát kálium-jodid réz-szulfát 5 H2

0 szacharóz biotin kolin-klorid inositol (meso) nikotinsav panto ténsav piridoxin riboflavin tiamin kinetin Koncentráció mg/l 950 185 220 68 30 7 4 2 0,1 0,4 0,12 20 000 0,1 1,0 1 000' 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,06 A sejtszuszpenziót 5 percig rázatjuk, újra ülepítjük, a fentmaradó tiszta, folyadékot leöntjük és eldobjuk, majd a mosást újabb adag MMSR táptalajjal megismételjük. 40 8. példa Differenciálódó Digitalis purpur ease jték te-35 nyésztése Az előző példa szerint nyert mosott sejt anyagot húsz, 250 ml-es, egyenként 25 ml MMSR táptalajt tartalmazó Erlenmeyer-lombik beoltására használjuk. Ezeket az edényeket rotáló rázógépen 28 °C-on, csökkentett fényben 10 napig inkubáljuk. Ez idő elteltével mindegyik edényben kis részecskék tömegét láthatjuk, ahol mindegyik részecske egy vagy több elágazó gyökér^5 kezdeményt tartalmaz. 9. példa 50 Szteroid glükozidák kimutatása Digitalis purpurea gyökérkezdemény tenyészetében Az előző példa szerint kapott Digitalis purpurea gyökérkezdeményt tartalmazó szuszpenzió-55 kat egyesítjük, és bordázott szűrőpapíron megszűrjük. Az összegyűjtött szilárd anyagot egy éjjelen át 60 °C-on szárítjuk, amikor 14 g szilárd anyagot kapunk. Ebből 100' mg-ot 3 ml 70"/0

^os vizes etanollal 1 óra hosszat visszafolyató hűtő 60 alatt forralunk, majd a kivonatot centrifuga segítségével elkülönítjük. Ezt követően a kivonatot nitrogénáramban 0,9 ml térfogatra bepároljuk, majd ezt a vizes maradékot kloroformmal kétszer kirázzuk. A teljes kloroformos kivonatot szi-65 liikagél vékonyréteg-ikramatográfiás lemezre visz-