165478. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyagcseretermékek előállítására növényi sejtekből fermentációval

165478 áttelepítésével, vagy friss, auxinhatástól mentes táptalajjal történő hígítással vagy antiauxin-hatású vegyület adagolásával biztosíthatjuk, miután a differenciálatlan tenyészetet kedvező szintre hoztuk. Abban az esetben, ha az auxinhatású anyag nem eléggé stabil, pl. 3-indol-ecetsav esetében az auxinhatásszint csökkentését természetes úton, az inkubációs idő megnövelésével érjük el. Nehéz vagy talán nem is lehet az abszolút axinhatásszintet — amelynél a differenciálatlan növekedés fenntartható — meghatározni, mert ez a szint függ az auxinhatású vegyülettől, de függ magától a növényi sejtfajtától is. Ez, a növényfajták és az auxinhatásszint között fenn^álló kölcsönhatás feltehetően a különféle növényfajtáknak az egyes auxinhatású anyagokkal szemben tanúsított eltérő érzékenységének a következménye, és feltehetően függ a fajtánként különböző, belső elválasztású auxin mennyiségétől is. Ezért kell adott növényfajta és auxinhatású anyag esetében kísérleti úton meghatározni a differenciálatlan növekedést biztosító auxinhatásszintet. Ezek a kísérletek a leggyakoribb auxinhatású vegyület, a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav esetében azt mutatták, hogy 2—20 . 10-6 mól/liter auxinhatású vegyület elegendő ahhoz, hogy számos növényfajtánál a differenciálatlan sejtnövekedést fenntartsuk. Túl magas auxinhatásszint mellett toxikus tünetek, mint gyenge növekedés, sejtpusztulás figyelhetők meg. Túl alacsony auxinhatásszintnél a differenciálatlan sejtnövekedés nem biztosítható. Nagyobb auxinhatással rendelkező vegyületeket, mint pl. 2,4,5--triklór-fenoxi-eeetsavat, kisebb koncentrációban alkailmazzuk. Fordítva, kevésbé hatásos auxinvegyületeket pl. 1-naftalin-ecetsavat nagyobb koncentrációban alkalmazunk. Természetesen, ha a növényi sejt differenciálódását auxinhatásszint csökkentésével kívánjuk elérni, célszerű, ha a differenciálatlan állapotban az auxinhatásszint nem sokkal nagyobb az okvetlenül szükséges szintnél. Ebben az esetben csak a minimális hígítást kell alkalmazni ahhoz, hogy a differenciálódás megkezdődjön. Általában kétszeres térfogatú friss, auxinmentes táptalajjal való hígítás elegendő. Nagyobb fokú hígítást magasabb auxinszinteknél használunk. Ha az auxinhatásszint csökkentését a differenciálatlan sejték mosásával érjük el, akkor a végső térfogat nem változik. Hasonlóképpen nincs térfogat-növekedés antiauxin-hatású anyag alkalmazása esetében sem. A differenciálódó növekedés megindításához az alacsony auxinhatás-szintű táptalajba, térfogatának 5—50%-át kitevő differenciálatlan növekedésben levő diszperz rendszert adunk (amit a Catharanthus roseus-nál leírtak szerint kapunk), majd rázott, forgatott vagy kevert edényben 15—35°C-on célszerűen 20--30 °C-on inkubáljuk, amíg a differenciálódás a kívánt mértékben bekövetkezik. Fenti körülmények között a tenyészetben kis formájú labdacsok (legnagyobb átmérője: 0,5—4 mm) képződnek, amelyek az eredeti növényi szerv mikroszkopikus vagy esetleg makroszkopikus képét mutatják. Ha a differenciálódó tenyészetben kedvező növekedést érünk el, azaz a kívánt anyagcseretermék megfelelő mennyiségben termelődött, ami 3 nap, 3 hét között áll be, a növényi kezdeményt tartalmazó 5 sűrű szuszpenzió feldolgozását megkezdjük; általában ekkor nyerjük ki a keresett anyagcsereterméket is. A kinyerést az anyagcseretermék természetétől függően oldószeres kivonással, vagy a növényi rostok szűrését követő rövid f or-10 rálássál és a termék kicsapásával, vagy a termék adszorpciójával, esetleg ioncsere segítségével végezzük el. Az elkülönítést rendszerint az egész növényi anyagból végezzük, de jelen találmány nem tér ki a termék elkülönítésének módjára. 15 Némely esetben a terméket nem is kell a növényi kezdemény tömegétől elválasztani. Lehet, hogy ez az anyag maga a keresett termék, pl. a magas lizintartalmú kukoricatörzs esetében jelen találmányt az olcsó szacharóz, ammónium, 20 nitrátion magas értékű proteinné való átalakításálhoz alkalmazhatjuk. A találmányt közelebbről megvilágítják a következő példák: 25 1. példa Beta vulgaris sejttenyészet készítése szokásos növényi tápanyagon és szilárd táptalajon való fenntartása 30 35 40 Közönséges vörösrépa, Detroit Select Globe fajtájú Beta vulgáris-magokat nedves szűrőpapíron csíráztatunk, amikor teljesen kifejlődtek, a csáráztatott magokat 5 percig 1% nátrium-hipoklorit-oldatba merítjük és ily módon sterilezzük. (Ezt követően minden, az élő szövettel kapcsolatos műveletet szigorúan aszeptikus körülmények között végezünk.) A csírákat steril, nedves szűrőpapírlapokra visszük, majd felvágjuk gyökéralsószár- szármetszetekre, és mindegyiket külön-külön 10 cm átmérőjű, 30 ml következő táptalajt tartalmazó Petri-csészébe visszük. MS táptalaj 45 Összetevők Fontosabb ásványi 50 ionok és nitrogénforrások Koncentráció mg/ml 55 60 Nyomelemek Szénforrás szilárdságot növelő 65 anyag kálium-nitrát 950 ammónium-Jnitrát 720 magnézium-szulfát 7 H2

0 185 kalcium-klorid 2 H2

0 220 kálium-foszfát &8 vas(II)-szulfát 7 H2

0 30 mangánTSzulfát H2O 7 cink-szulfát 7 H2

0 ' 4 bórsav, vízmentes 2 ammónium-molib dát 0,1 kálium-jodid 0,4 réz-szulfát 5 H2

0 0,12 Szacharóz 20 000 agar 10 000