165478. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyagcseretermékek előállítására növényi sejtekből fermentációval
165478 6 az auxinhatású anyagokat embrionális sejtnövekedést serkentő anyagként említik. Jelen találmány szerinti eljárásban auxinhatású anyagként 3-indol-ecetsavat, 3-indol-vajsavat, 1-naftalim-ecet savat, p-4dór-fenoxi-eoetsavat, 2,4-diklor-fenoxi-ecetsavat, 2,4,5-triklár-fenoxi-eoetsavat stb.-t használtunk. Ismeretesek az ún. antiauxin anyagok is, amelyek gátolják vagy semlegesítik az auxinhatású anyagok fitohormon-tevékenységét. Jellemzően auxinhatású anyagok az 1-naft-oxi-eoetsav, fahéjsav, tropánsav, 2,3,5-trijód-'benzoesav és 2,4,6-triklór-fenoxi-ecetsav. A differenciálatlan növényi sejtek termelésére számos táptalaj-összetétel található az irodalomban. Pl. White P. R. táptalaj-összetétele a következő alkatrészeket tartalmazza: Összetevő: Koncentráció mg/l kalcium-nitrát 200 magnézium-szulfát 360 kálium-nitrát 80 kálium-klorid 65 nátrium-szulfát 200 nátrium-dihidrogén-foszfát 16,5 vas(II)-szulfát 2,5 kálium-jodid 0,76 mangán-szulfát 4,5 cink-szulfát 1,5 bórsav 1,5-tiamin 0,1 piridoxin 0,1 nikotinsav 0,5 glicin 3,0 szacharóz 20 000 naftalin-ecetsav szükség szerint A Heller-féle táptalaj összetétele: kálium-klorid 750 nátrium-fnitrát 600 magnéziumszulfát 1 'H2 0 i 250 nátrium-dihidrogén-foszfát H2 0 125 kalcium-klorid 2H2 0 75 szacharóz 20 000 továbbá a következő nyomelemek: vas(III)-klorid 1,0 cink ^szulfát 1,0 bórsav 1,0 mangán-szulfát 0,1 réz-szulfát 0,03 alumínium-rklorid 0,03 nikkel-klorid 0,03 kálium-jodid 0,01 nátrium-molibdát 0,03 Ezt a táptalajt, hasonlóan az irodalomban található egyéb táptalajokat, szükség szerint a megfelelő hatás biztosítására auxinhatású vagy antiauxin-hatású és/vagy citokininekkel egészítjük ki. Általában azt mondhatjuk, hogy az alap táptalajnak nincs nagy jelentősége, minthogy ez csak a növényi anyag növekedését biztosítja. Azt találtuk, hogy a Linsmaier és Skoog (29. példa) vagy a Gambory (10. példa) táptalaj egyaránt alkalmas mindenféle növényi anyag tenyésztéséhez. Jelen találmány alkalmazásához először fe a kívánt növényi fajtából erőteljesen növekevő differenciálatlan sejttenyészetet kell előállítani; jelenleg a növényi szövetek tenyésztésének tech-5 nikája ezt egyszerű kísérleti úton lehetővé teszi. Pl. a Catharanthus roseus egysejt-tenyészetét oly módon állítjuk elő, hogy a Catharanthus roseus élő, csíramentes szármetszetét auxinhatású táptalajjal készült agarlemez felületére leoltjuk. 10 Célszerűen a sejtosztódást elősegítő citokinint, kinetint vagy zselatint adunk hozzá. A táptalaj a szokásos fémeket, nyomelemeket, asszimilálható szén- és nitrogénforrást, mint ammóniát, nitrátiont és egy vagy több B-vitamint tartalmaz. 15 25—35 °C-on inkubálva néhány nap (hét) elteltével az eredeti inokulum metszetén új, szervezetlen hegsejtnövekedés észlelhető. Az új sejteket lemetsszük, és aszeptikusán egy új agarlemezre vagy célszerűen az agar elhagyásával hasonló 20 összetételű folyékony táptalajra visszük, rázógépen ismét 15—35 °C között inkubáljuk. A további növekedés során a sejtanyagot ismételten friss táptalajba visszük, külön ügyelve arra, hogy az előző inkubációs szakaszban kifejlődött kisebb 25 aggregátumokat is átültessük. Többszöri, ismételt friss táptalajba történő átültetés után egy diszperz tenyészet alakul ki, vagyis a vizes táptalajban kizárólag differenciálatlan egy^sejtek és ezekből kialakult sejtcsomók szélesztett rendisze-30 re alakul ki. A törzstenyészet fenntartásának ez a legkedvezőbb módja. Ezen az anyagon a növényi szervezet bármilyen szelektálása és mutációja, a mikroorganizmusokéhoz hasonlóan, elvégezhető, így ebből a tenyészetből akár mutá-35 cióval, akár anélkül, új sejttörzseket fejleszthetünk ki. Legkedvezőbb a kívánt anyagcseretermék megnövelt termelőképessége alapján történő szelektálás, amit kísérletek segítségével végezhetünk el. 49 A táptalaj és a többi növekedést befolyásoló feltétel, amely a differenciálatlan egy-sejteket vagy sejtcsomókat differenciálódásra és ily módon az anyagcsereterméket előállító szervkezdemény kialakítására késztet, kísérletileg alakítha-45 tó ki. A tenyészet differenciálódásának szakaszát szilárd, félszilárd vagy folyékony fázisban, célszerűen ez utóbbiban alakíthatjuk ki. A differenciálatlan sejteket és sejtcsomókat, amelyeket preembrióknak is nevezhetünk, a mikroor-50 ganizmusokhoz hasonlóan célszerű süllyesztett, levegőztetett folyékony rendszerben tenyészteni. Süllyesztett, aerob tenyészetben a táptalajhoz nem adunk gélképzőt, bár a kis koncentrációban alkalmazott agar vagy metil-cellulóz a viszkozi-55 tás növelésével és ezáltal a kevert rendszerben a nyírófeszültség megváltoztatásával kedvező hatást fejthet ki. Ezenkívül a táptalaj tartalmazza a szokásos ásványi sókat, nyomelemeket, szén-, nitrogén- és foszforforrást, egy vagy több B-vi-60 tamint. A differenciálatlan sejtállapotból a differenciálódó, anyagcsereterméket termelő állapotba való átmenetet a táptalaj auxinhatásszintjének csökkentésével érjük el. A csökkentett auxinhatásszintet, a differenciálatlan sejteknek 65 egy csökkent auxinhatás-szintű táptalajba való
