165408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-helyettesített 7béta-(D-5-amino-5-karboxi-vaIeramido)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
165408 41 lumot adagoltunk, a termelő VII. tápközeg oszszetétele csupán két további alkotórész jelenléte, valamint a pH-érték csekély eltérése tekintetében különbözik az inokulum előállítására alkalmazott, fent ismertetett VII. tápközegtői: Termelő VII. tápközeg: L-aszparagin L-hisztidin DL-fenilalanin mononátrium-giutamát nátriumiklorid dikáliumhidrogénfosz f át CaCi2 . 2H 2 0 M118O, . H2 0 FeSO/, . 7H2 0 ZnS04 . 7H 2 0 MgS04 .7H 2 0 glicerin szacharóz desztillált víz 5.0 g 4,0 g 2.0 g 1,5 g 5,0 a 0 2,0 g 0,4 g 0,1 LT 0,1 g 0,05 g 1,0 g 20,0 g 1000.0 ml pH-érték nátriumhidroxiddal 7,1-re állítva. A beoltott lombikokat 24 °C hőmérsékleten rázattuk 220 percenkénti fordulatszámmal működtetett rázókészülékben, majd a lombikok tartalmát egyesítjük és 4 napi, valamint 5 napi inkubálás után meghatározzuk a képződött antibiotikum mennyiségét. Ennek során a fermentációs levet sósavval 4,0 pH-értékre savanyítjuk, majd leszűrjük, és 5,0 pH-értékű foszfát-pufferoldattal 1: 4 arányban hígítjuk. Az antibiotikum-tartalmat a szokásos korongmódszerrel vizsgáljuk 1,2 cm átmérőjű korongok alkalmazásával, Proteus vulgaris MB—838 törzzsé] szemben. A kapott gátlási zóna átmérője a 4 napi inkubáltatás utáni fermentációs termék esetében 25,5 mm volt; a termékben jelenlevő antibiotikumot 810A antibiotikumként azonosítottuk. 5. példa 810A antibiotikum előállítása és alkotórészeire való szétválasztása A) Fermentáció 1. lépés: Egy MA—2837 Streptomyces griseus liofilizált kultúrát tartalmazó kémcső tartalmát 2 ml I. tápközegben (összetételét az 1. példában ismertettük) szuszpendáljuk, és az így kapott Inokulumot ugyanilyen tápközeget tartalmazó ferde táptalajok beoltására használjuk fel. A ferde agáron a kultúrákat 5 napig inkubáltatjuk 28 °C hőmérsékleten (illetőleg a jő spóraképzés eléréséig folytatjuk az inkubáltatást), majd az így kapott ferde agaros kultúrákhoz 10—10 ml VIII. tápközeget adunk; ennek összetétele: VIII. tápközeg: húskivonat nátriumklorid 42 „NZ Amine" (pankreász enzimmel hidrolizált kazein) dextróz pH = 7,0. 1,0% A ferde táptalajon fejlődött kultúrákat lekaparás útján szuszpendáljuk a hozzáadott folyékony tápközegben, majd az így kapott szuszpenziót inokulumként használjuk fel az alábbi 2. lé-10 pésben. 2. lépés: Az 1. lépésben kapott szuszpenzióval beoltunk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban elhelyezett 50 ml sterilizált VIII. tápközeget (összetételét fentebb ismertettük). A beoltott 15 lombikot 48 óra hosszat inkubáljuk 28 °C hőmérsékleten, egy percenként 220 fordulattal működtetett rázókészüléken. 3. lépés: A 2. lépésben kapott inokulumlombik tartalmát egy 2 literes bedugaszolt Erlen-20 meyer-lombikban elhelyezett 500 ml VIII. tápközeg (összetételét fentebb ismertettük) beoltására használjuk fel. Az így beoltott lombikot 48 óra hosszat inkubáljuk 28 °C hőmérsékleten, egy percenként 220 fordulattal működtetett rázóké-25 szüléken. 4. lépés: A 3. lépésben kapott 500 ml kultúrával beoltunk egy rozsdamentes acélból készült, 900 liter űrtartalmú fermentorban elhelyezett 467 liter steril VIII. tápközeget (a fentebb is-30 mertetett összetételben). A fermentációt 28i°C hőmérsékleten 65 óra hosszat folytatjuk keverés (percenként 130 fordulattal) és levegőztetés (percenként 283 liter levegővel) közben. A fermentáció során a túlzott habzás megelőzése céljá-35 ból a szükséghez képest kis mennyiségű „poliglikol 20O0" hábzásgátló szert adunk a fermentációs léhez. 5. lépés: A 4. lépésben kapott fermentációs lé 450 liternyi mennyiségét inokulumként hozzá-40 adjuk egy rozsdamentes acélból készült 7 m3 -es fermentorban levő 5,4 m3 IX. tápközeghez; e tápközeg összetétele: 0.3% 0,5% 45 50 55 60 65 IX. tápközeg: kukoricalekvár dextróz 4% 2»/n pH-érték nátriumhidroxiddal 7,2-re állítva. A fermentációt 28 °C hőmérsékleten folytatjuk keverés (percenként 120 fordulattal) és levegőztetés (percenként kb. 1500 liter) mellett, 30—36 óra hosszat. A fermentáció folyamán a túlzott habzás gátlására „poliglikol 2000" hábzásgátló szert adunk csekély mennyiségben a fermentációs közeghez. A fermentáció befejeztével a fermentációs közegben képződött antibiotikum mennyiségét a szokásos korongmódszerrel határozzuk meg, 12 mm átmérőjű korongok alkalmazásával. Proteus vulgaris MB—838 kultúrával szemben 31 óra alatt 32,5 mm átmérőjű gátlási zónát kapunk.
