165408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-helyettesített 7béta-(D-5-amino-5-karboxi-vaIeramido)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsav-származékok előállítására
185408 lenmeyer-lombikokban levő II. tápközeg összetétele az alábbi: íí. tápközeg: marhahúskivonat 3,0 g ,,NZ-Amine" (pankreász enzimmel hidrolizált kazein) 10,0 g dextróz 10,0 g nátriumiklorid 5,0 g desztillált víz 1000,0 ml pH-érték nátriumhidroxiddal 7,2-re állítva. Az így beoltott Erlenmeyer-lombikokat forgó rázókészülékben, percenként 220 fordulattal (5 cm lökettel) 3 napig rázatjuk. A kapott rázott kultúrát azután arra használjuk fel, hogy beoltsunk vele tizenegy kétliteres Erlenmeyer-lombikot, amelyek mindegyike 350 ml III. tápközeget tartalmaz; a beoltásra 2—3% inokulumot alkalmazunk. A III. tápközeg összetétele az alábbi: III. tápközeg: dextróz 10,0 g aszparagin 1-0 g K2 HP0 4 0,1 g MgS04 . 7H 2 0 0,5 g élesztőkivonat 0,5 g nyomelemelegy (2. sz.) 10,0 ml desztillált víz 1000,0 ml pH-érték nátriumhidroxiddal 7,2--re állítva. A 2. sz. nyomeL em elegy összetétele: FeS04 . 7H 2 0 1,0 mg M11SO4 . H2 0 1,0 g CuCl2 . 2H 2 0 25,0 mg CaCl2 100,0 mg H3BO3 56.0 mg (CH4 ) 6 Mo 7 0 2í . 4H2 Q 19.0 mg ZnS04 . 7H 2 0 200,0 mg desztillált víz 1000,0 ml A beoltott lombikokat 28 °C hőmérsékleten 4 napig rázattuk egy 5 cm löketű rázókészülékben, percenként 135—150 fordulattal. Az inkubálási időszak befejeztével a 11 lombik tartalmát egyesítettük, és meghatároztuk az antibiotikum-tartalmat. Az egyesített centrifugált fermentlé a korongmódszerrel mérve (12 mm átmérőjű korongokkal) 22 mm átmérőjű gátlási zónát mutatott, a szabványos módon elkészített lemezeken, Proteus vulgaris mikroorganizmussal szemben. A kapott antibiotikus hatású terméket 810A antibiotikumként azonosítottuk, vagyis ez a hatóanyag oly antibiotikum-elegy, amely 7/?-(D-5--amino-5-<karboxi-valeramido)-3-(a-metoxi-p-szulfoxi-cmnamoilmetil)-7-metoxi-cef-3-em~4--karbonsavat és 7/?-{D-5-amino-5-karboxi-valeramido)-3^(a-metoxi-p-hidroxi-cinnamj0iloximetil)-7-metoxi-cef-3-em-4-karbonsavat tartalmaz. 2. példa A 810 A aniíbiolíksra előállítása 5 Egy MA—2837 Streptomyces griseus törzs liofilizált kultúráját tartalmazó kémcsövet aszeptikus körülmények között kinyitunk, és a kémcső tartalmával az 1. példában leírt I. tápközegből álló ferde agar táptalajokat oltunk be. A bs-10 oltott ferde táptalajokat 28 °C hőmérsékleten egy hétig inkubáljuk, majd felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk őket. Az inkubált ferde tápközegek egyikén kapott kultúra egy részével beoltunk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 15 levő 50 ml II. tápközeget (összetétel az 1. példa szerint). Az így beoltott tápközeget 28 °C hőmérsékleten két napig inkubáljuk egy 51 cm-es löketű, percenként 220 fordulattal működtetett rázókészülékben. Az így kapott inokulumot'az-20 után aszeptikus körülmények között lemossuk, a kapott szuszpenzióbői a micéliumot centrifugálással elkülönítjük, a szupernatáns folyadékot kiontjuk, és a micéliumot az előző folyadéktérfogattal megegyező térfogatú sóoldatban szusz-25 pendáljuk, újból centrifugálunk, majd a micéliumot ismét szuszpendáljuk 0,9%-os nátriumklorid-oldatban. Az így mosott micéliummal azután beoltunk két 250 ml-es Erienmeyer-lombikot, amelyek mindegyike 50 ml alább megadott ösz-30 szetételő termelő tápközeget tartalmaz. A beoltáshoz 2% inokulumot alkalmazunk; a tápközeget beoltás előtt 120 °C hőmérsékleten 15 percig sterilizáljuk. A termelő tápközeg a következő összetételű: 35 Termelő tápközeg: 40 45 50 L-prolin 15,0 g glicerin 20,0 g szacharóz 2,5 g mononátrium-; glutamát 1.5 g NaCl 5,0 g K2 HP0 4 ..2,0 ,g CaCl2 . 0,4 g MnCÍ2 . 4H 2 0 0,1 g FeCl3 . 6H9O 0,1 g ZnCl2 0,05 g MgS04 . 7H 2 0 1,0 g desztillált víz 1000,0 ml pH-érték (beállítás nélkül) 7,1. A termelő tápközeget tartalmazó lombikokat egy 5 cm löketű rázókészülékben, percenként 220 fordulattal 4 napig rázatjuk 28 °C hőmér-55 sékleten. A 3. és 4. napon meghatározzuk a fermentációs közeg antibiotikum-aktivitását. A kivett mintákat centrifugáljuk és a szupernatáns folyadékot Petri-csészékben levő agarlemezen a szabványos módszerrel vizsgáljuk, 12 mm átmé-60 rőjű korongok alkalmazásával. Proteus vulgaris MB—838 törzzsel szemben 3 nap után 21 ml átmérőjű gátlási zónákat, 4 nap után pedig 26 ml átmérőjű gátlási zónákat kapunk. A termékben levő antibiotikus hatású . anyagokat 8'10A 65 antibiotikumként azonosítottuk.
