165354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú növekedési hormon kinyerésére emberi agyalapi mirígyből

165354 3 Acta, 74, 525 (1963); Int. J. Prot. Res., 1, 85 (1969); Arch. Biochem. Suppl 1., 1, 327 (1962)]. Ezektől az eljárásoktól alapvetően csak U. S. Raben módszere [Rec. Progr. Hormone Res., 15, (1959)] tér el, amely szerint az aceton-száraz szervporból jégecettel 70 C°-on vonják ki a hatóanyagot, majd éteres kicsapással koncentrálják: a további tisztítást ioncserélő cellulóz alkalmazásával és etilalkoholos kicsapással végzik. A növekedési hormon előállítására alkalmazott ismert eljárások kivétel nélkül sok lépésből álló fehérje-izolálási műveletkombinációk, közülük azonban csak kevés nyújt gyógyászati készítménynek megfelelő tisztasági fokot. Különleges problémát jelent ugyanis az agyalapi mirigyből történő hormonkinyerésnél, hogy a kísérő „szennyezések" jórésze specifikus hormonhatású anyag, amelyek molekulasúlyuknál fogva még antigénként vagy allergizáló faktorként is viselkednek, így a készítmény nem kívánatos hatásokat válthat ki. Sajátos nehézségként merül fel azonban az is, hogy a növekedési hormon könnyen polimerizálódik: ez a változás a biológiai hatás elvesztését eredményezi és így az izolálási eljárás hatásfokát is hátrányosan befolyásolja. Jelenleg még nem ismert az utóbbi hátrány elkerülésének módja, így a szervgyűjtéstől kezdve a kivonás és a tisztítási műveletek különböző módozatai befolyásolhatják a növekedési hormon ilyen jellegű átalakulásait. Erre mutat az a megfigyelés, hogy mélyhűtésben gyűjtött agyalapi mirigyből közel kétszer annyi növekedési hormon nyerstermék állítható elő, mint acetonban gyűjtöttből [Endocrinology, 71, 559 (1962); Hormone Metab. Res., 2, 174 (1970)]. A találmány célja olyan üzemi méretben is megvalósítható eljárás biztosítása, amely kiküszöböli a már ismert eljárások hátrányait, és nagy aktivitású és gyógyászati célra is alkalmas tisztaságú emberi növekedési hormon előállítását teszi lehetővé. A találmány alapja az a felismerés, hogy a kivonásra előnyösen használható az 50—80 tf% acetont vagy metil- vagy etilalkoholt tartalmazó 1—3 pH-jú vizes oldat. Ez azért meglepő, mert nem ismeretes, hogy olyan nagy molekulasúlyú polipeptid, mint a növekedési hormon, 50-80 tf% acetont vagy alkoholt tartalmazó vizes elegyben oldódnék. Az ismertetett irodalmi adatokból ennek éppen az ellenkezője következik: már 20-30 tf% alkohol jelenlétében pH 5-9 tartományban a növekedési hormon kicsapását érik el [J. Am. Chem. Soc. 80, 4429 (1958); Endocrinology, 71, 559 (1962); Arch. Biochem. Suppl., 1, 327 (1962)]. E kedvező kivonó hatáson kívül előnyként jelentkezik az a nem várt tapasztalat, hogy a találmány szerint alkalmazott oldószer-elegyben — a savas vegyhatás ellenére — az agyalapi mirigy gonadotrop hormonjai nem oldódnak ki, ennélfogva elkülönítésükre nem szükséges további tisztítási lépést beiktatni. Az ismert kivonási módszerekkel ugyanis a gonadotrop hormonok is oldatba kerülnek és az extrakciót követő kicsapási műveletben a növekedési 4 hormonnal együtt válnak ki, vagyis a terméket szennyezik [Acta Endocrin., 56, 626 (1967)]. Ezért ezeket néhány eljárásban még a növekedési hormon kivonása előtt eltávolítják a szervből fajlagos kiol-5 dással [Canad. J. Biochem., 39, 1459 (1961); Biochem. J., 100, 754 (1966)]. A találmány további alapja az a felismerés, hogy a növekedési hormon kivonására használt vízzel elegyedő szerves oldószerek közül az aceton koncentráló dójának 85—95 tf%-ra való növelésekor a növekedési hormon maradéktalanul kicsapódik a közegből. Ez új megállapítást jelent a növekedési hormonnal kapcsolatos ismeretanyagban, hiszen arról van szó, hogy az oldószernek a hormon kioldását elősegítő hatása a 15 koncentrációnövelés adott szintjén megszűnik. Ilyen összefüggés eddig csak a sók vonatkozásában volt ismeretes. Figyelemre méltó, hogy alkoholok esetén nem találtunk hasonló összefüggést, de acetonnal alkohol tartalmú elegyből is ki lehet csapni a növeke-20 dési hormont. A találmány alapja az a felismerés is, hogy az acetonos kicsapással nyert anyag jól oldódik vízben: viszonylag kis térfogatú desztillált vízben maradéktalanul oldódik, majd a desztillált vízben oldott anyag-25 ból a növekedési hormon kicsapással tisztítható, ha a közeg pH-ját 4,8-5,2 közötti, előnyösen pH 5-re állítjuk. Végül a találmány alapja az a felismerés, hogy a növekedési hormon előállítás befejező tisztítási 30 lépésében, az egyébként ismert gélszűrésen alapuló elválasztásban lúgos vegyhatású közeg előnyösen alkalmazható. Ez azért meglepő, mert lúgos közegben — különösen olyan hosszú időtartam alatt mint amit a gélszűrés igényel — a polipeptidek könnyen dezami-35 dalodnak. Ezért a növekedési hormonnal kapcsolatos szakirodalomban a gélszűrésnél gyengén savas oldószerekben dolgoznak [Biochim. Biophys. Acta. 74, 525 (1963); Int. J. Prot. Res., 1, 85 (1969)]. A lúgos vegyhatás előnyét egyrészt abban tapasztaltuk, hogy a 40 pH 5-ön végzett kicsapással nyert termék oldása lúgos közegben a növekedési hormon biológiailag aktív monomer formájának jó hatásfokú kioldását és egyben a kísérő szennyezéseknek oldatlan állapotban való visszatartását eredményezi, másrészt a molekulasúly 45 szerinti elválasztás a gélen élesebbé válik. A találmány eljárás nagytisztaságú emberi növekedési hormon előállítására acetonos dehidrálással vagy mélyhűtéssel konzervált agyalapi mirigyből kivonás, a kivonatból kicsapás, oldás, újabb kicsapás, majd 50 gélszűrés útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a szerv kivonatolását 50—80 tf% aceton vagy metil- vagy etilalkohol tartalmú 1—3 pH-jú vizes oldattal végezzük, a kivonatból a növekedési hormont tartalmazó frakciót aceton hozzáadásával kicsapjuk, a 55 csapadékot desztillált vízben oldjuk, majd a növekedési hormont az oldat pH-jának 4,8—5,2 közötti, előnyösen 5 értékre állításával kicsapjuk és a gélszűrést 7,5-8,5 pH-jú vizes közegben végezzük. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei: 60 a) Az eddig ismert módszerek helyett egysze-2