165354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú növekedési hormon kinyerésére emberi agyalapi mirígyből

165354 rűbben és gazdaságosabban teszi lehetővé olyan tisztaságú növekedési hormon előállítását, amely gyógyászati célra is alkalmas aktivitású és tisztaságú. b) A szervgyűjtési megoldástól függetlenül alkalmas növekedési hormon előállítására. Ez azért fontos, mert ma még nem minden gyűjtőhelyen áll rendelkezésre a jóval költségesebb mélyhűtést biztosító berendezés; ezért nagy jelentőségű, hogy az eddig ismert módszerekkel alacsony hozamot adó acetonos szervgyűjtési mód a találmány szerinti eljárás esetén megközelíti vagy eléri azt a szintet, mint a mélyhűtéssel tárolt szervek feldolgozása. c) A kivonás hatásfoka független a megadott határok között az aceton koncentrációjától, így az acetonos gyűjtőié is felhasználható extraháló oldatként a megadott koncentrációra és pH-ra beállítva. d) A találmány szerinti eljárás üzemben is könnyen kivitelezhető technológiát jelent. Az eljárásban használt magas aceton-koncentráció azért nem jelent nehézséget, mert a kicsapási közegben az anyag jól tömörül, gyorsan és élesen elválik, ily módon mellőle a magas aceton tartalmú oldat dekantálással elkülöníthető. 10 15 20 e) A művelet már a kivonás és a kivonatból történő kicsapás körülményei között igen fajlagos a növekedési hormonra nézve, ezért rövid úton, kevés lépéssel magas aktivitású anyag kinyerését teszi lehetővé. f) A termék toxikus, allergizáló vagy egyéb hormonhatású anyagokat nem tartalmaz. Ezt a termék gélszűréses analitikai és ultracentrifugás vizsgálata is alátámasztja: a készítményben a növekedési hormonnál nagyobb molekulasúlyú komponensek nem találhatók. Gélelektroforetikus képében a nativ hormonon kívül csak annak dezamidálódott származéka látszik. Ez megfelel az A. E. Wilhelmi professzortól kapott standard növekedési hormon preparátum (HS 1394, 2 IU/mg) gélelektroforetogramjának. Az eljárásunk szerint nyert termék biológiai teszten gonadotrop hormon aktivitást nem mutat. A találmány szerinti eljárás hatékonyságának szemléltetésére az alábbi táblázatban eljárásunkat két ismert módszerrel és a Wilhelmi-féle standard készítménnyel hasonlítjuk össze részben a kitermelés, részben a tibia porc-szélesség változásával kifejezett biológiai hatékonyság alapján: 1 • ...... Eljárás Kitermelés mg/g nedves szövet Biológiai hatékonyság (tibia porc-szélesség: ju) Li és munkatársa

1 Roos és munkatársa2 Wilhelmi3 Saját OMg 20 Mg 60/ug+ Li és munkatársa

1 Roos és munkatársa2 Wilhelmi3 Saját 1,0-2,5 5,0 1,5-3,0 1,5-3,0 161 ±2 174 ±4 165 ±5 151 ±2 217 ± 3 255 ± 14 205 ± 7 295 ± 2 259 ± 3 258 ±5 253 ±3 4- összdózis 1 [Arch. Biochem., Suppl., 1, 327 (1962] 2 [Biochim. Biophys. Acta, 74, 525 (1963] 3 A. E. Wilhelmi, Emory University, Atalanta, Georgia, USA, készítményének biológiai aktivitása 2 IU (nemzetközi egység) mg-onkint A biológiai hatékonyság meghatározása a készítmények intraperitoneális beadása után történt F. S. Greenspan és munkatársai módszerével [Endocrinology, 45,455 (1949)]. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa 300 db acetonban gyűjtött és eltartott agyalapi mirigyet dolgozunk fel. Az agyalapi mirigyről leöntjük az acetonos gyűjtőfolyadékot: ennek térfogata 120 ml, az agyalapi mirigy „nedves"-súlya 150 g. A gyűjtőfolyadékhoz 350 ml acetont, 120 ml vizet és 15 ml tömény sósavat adunk. Az így előállított extrakciós elegyet 0-4 C°-ra hűtjük és 2oo ml mennyiséget a szervhez adunk. Az aprítást forgókéses homogenizátorban végezzük. A pépesre aprított agyalapi mirigyet egyesítjük az extrakciós elegy félretett részével és 1 óra hosszat keverjük. A felülúszót centrifugálással különítjük el a szervmaradéktól. A szervmaradékot 200 ml aceton, 100 ml víz és 6 ml tömény sósav elegyével 1 órán keresztül tovább extraháljuk majd centrifugálással ülepítjük. A két extrakció során nyert felülúszó oldatokat egyesítjük. 45 A kapott 850 ml oldathoz 7 1 -előzetesen 0 10 C° hőmérsékletűre lehűtött- acetont adunk a növekedési hormon kicsapása céljából. A csapadékot éjszakán át 0 — 4 C°-on ülepedni hagyjuk, majd. dekantálás után az acetonos felülúszót elöntjük. A 50 csapadékot 15 percig szárítjuk levegő átáramoltatásával, azután 100 ml desztillált vízben oldjuk. Az oldathoz keverés közben cseppenkint tömény ammónium-hidroxidot adunk amíg a 0-4 C°-on tartott oldat pH-ja 5-ig nem emelkedik. A kicsapódott 55 anyagot hűtött centrifugában ülepítjük. Az üledéket 50 ml, ammónium-hidroxiddal pH 8,5-re állított vízben oldjuk és liofilizáljuk. Aliofizátumsúlya 1,8 g. Az 1,8 g liofilizált preparátumot 40 ml 0,05 mól ammónium-hidrogén-karbonát-oldatban (pH 8) old-60 oldjuk. Az oldatlan részt centrifugálással kiülepítjük 3