165227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szájhigiéniában használható enzimek és ilyen enzimeket tartalmazó készítmények előállítására
5 165227 6 A fagyasztva szárított, in vitro előállított oldhatatlan nyers poliszacharidból a cariogenant az előzőekben leírt eljárással nyertük ki. Cariogtenan előállítása in vitro sejt-mentes Streptococcus mutans táptalaj segítségével 5 5 ml sejtmentes Streptococcus mutans SL—1 tartalmú táptalajt, amelyet 5,2 pH-nál leszűrve adtunk 25 ml 6 súlytérfogatszázalékos szacharóz oldathoz (0,1 M 7,0 pH-jú tompító oldatban), az 10 elegyet 0,45 mikron pórusú szűrőn átszűrjük, 7 napig 37 C°-on inkubáljuk. A poliszacharidokat centrifuga alkalmazásával elkülönítjük, kétszer 12 ml desztillált vízzel mossuk, majd mintegy 2 ml desztillált vízben újra szuszpendáljuk és fagyasztással 15 szárítjuk. A cariogenant a fentiekben leírt eljárással különítjük el. Cariogenan szerkezetének meghatározása a) Infravörös spektroszkópia A cariogenan infravörös spektruma (Nujol) 840 cm_1 -nél mutat egy csúcsot, amely a glukozid kötés a-konfigurációját igazolja, 890 cm_1 -nál az abszorpció teljes hiánya a j3-glukozidos kötés hiányára utal. 25 b) Savas hidrolízis A cariogenant 2 n kénsawal (10 mg/ml) 48 óráig hidrolizáltuk. Báriumkarbonáttal semlegesítettük és centrifugálás után tiszta oldatot kaptunk. A vékonyréteg és papírkromatográfiás vizsgálat alapján glukóz 30 volt az egyetlen monoszacharid. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatot G szilikagél lemezeken (Analtech Inc.) két futtató rendszerrel végeztük. I. rendszer: n-butanol- acetonvíz 4:5:1 arányban; II. rendszer: n-butanol-ecetsav-víz- 35 etiléter 9:6:1:3 arányban. A kifejlesztett lemezeket levegő áramban szárítottuk. A lemezeket 30 percig vákuum exikkatorban helyeztük el és így a maradék butanolt és ecetsavat eltávolítottuk. A kifejlesztett lemezeket 5%-os ezüstnitrát oldattal befújva 10 percig 40 110 C°-on melegítettük vagy naftol-rezorcin reagenssel befújva 15 percig 100 C -on melegítettük és hívtuk elő a cukorfoltokat. A cariogenant cariogenanázzal hidrolizáltuk és a kapott hidrolizátum mólsúlyának ellenőrzéséhez a 45 dextranázzal elbontott lineáris dextrán 100-at (Sigma), továbbá dextrózt és raffinózt alkalmaztunk összehasonlító anyagként. Az enzimatikus és savas hidrolízis termékeit 20x50 cm méretű Whatman 1. papíron leszálló 50 módszerrel vizsgáltuk. A kromatogramokat két és fél napon keresztül fejlesztettük n-butanol- piridin-víz 6:4:3 elegyével. A cukrok foltjait acetonos ezüstnitrát oldattal hívtuk elő (Trevelyan W.E., és társai: Natura 166,444(1960). 55 c) Parciális savas hidrolízis A cariogenan savas hidrolízisét oly módon végezzük, hogy 300 mg cariogenant 3 ml 66%-os kénsavban oldunk és szobahőmérsékleten tartjuk 15 percig. A hidrolizátumot báriumhidroxiddal semlege- 60 sítettük és desztillált vízzel 100 ml-re hígítottuk. A báriumszulfát csapadék eltávolítása után a báriumhidroxid feleslegét báriumkarbonáttal távolítottuk el, oly módon, hogy kis darab száraz jeget adtunk az oldathoz. A báriumkarbonátot centrifuga alkalma- 65 zásával távolítottuk el. A tiszta oldatot tízszeres térfogatra töményítettük be. A vékonyréteg- és papírkromatográfia segítségével nigerotriózt (0-a-D-glukopiranozil- (1*3) O-a-D-glukopiranozil- (1*3)- 0-a-D- glukopiranóz), kojibiózt (0-a-D-glukopiranozil- (1*2)- 0-a-D- glukopiranóz), nigerózt (Oa-D-glukopiranozil- (l*3)-0-a-D- glukopiranóz) és glukózt lehetett kimutatni. Izomaltózt vagy izomaltotriózt (l*6-kötésű oligoszacharidok)nem lehetett kimutatni. d) Perjodátos oxidáció A perjodátos oxidációt Smith szerint módosított eljárással végeztük el, ahogy Misaki és társai (Agr. Biol. Chem. 32,432 (1968) dextrán tanulmányaikban leírják. A cariogenan összes glukóz-tartalmát az antron módszerrel meghatározva a poliszacharid mg mennyiségére mérve 5,54 mikromól vízmentes glukózt mértünk. Ez miligrammonként 1,53 mikromól perjodátot fogyasztott (5,54 mikromól vízmentes glukóz). A perjodátos oxidáció befejeződése után a szárazanyag mg-jaira számítva mindössze 0,05 mikromól hangyasav keletkezett. e) Bórhidrides redukció A cariogenan szuszpenziót parciális Smith lebontásnak vetettük alá. A keletkező polialdehideket nátrium-borohidrides redukciónak vetve alá nem kaptunk oldható polialkoholckat. A polialkoholokat összes dextróz tartalomra vizsgáltuk, amikor a polialkohol mg-jaira számítva 3,8 mikromól glukóz-tartalmat mértünk. A polialkohol hidrolízise során nem keletkezett eritritol, ezzel szemben glicerol képződést lehetett megfigyelni. Cariogenanáz hatásának in vitro vizsgálata S. mutans segítségével in vitro 5 kisméretű edény alján és falán lerakódást állítunk elő. Az egyes edényekben lévő lerakódást az alábbi módon kezeljük. 1. víz, 2. cariogenanáz (250 egység)ml, 3. dextranáz (250 egység)ml, 4. cariogenanáz és dextranáz (250+250 egység)ml, 5. cariogenanáz és dextranáz (250+250 egység)ml + forralás A lombikokat enyhe rázás közben 3 óra hosszat inkubáljuk, majd az oldatban lévő felülúszót leöntjük. A lerakódás az egyes edényekben az alábbi százalékban szűnik meg: 1. víz 18,3% 2. cariogenáz 28,5% 3. dextranáz 24,5% 4. cariogenáz+dextranáz 91,5% 5. cariogenanáz+dextranáz+ forralás 14,7% Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimek együttesen nagyobb hatást biztosítanak mint a két enzim külön-külön hatásának összege. Abban az esetben, ha az enzimek elegyét tartalmazó vizsgálati anyagot forraljuk, az enzimek dezaktiválódnak és a hatás nagysága a víz hatására csökken le. 3
